胡欣春 魏益平 喻東亮 彭金華 徐建軍

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科，江西 南昌 330006)

肺癌的高死亡率主要是因?yàn)榛焹H能殺滅對化療藥物敏感的腫瘤細(xì)胞，而無法有效殺滅天然耐藥或通過突變獲得耐藥能力的腫瘤細(xì)胞〔1〕,使得腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)和耐藥，最終導(dǎo)致治療的失敗。近年來的研究證實(shí)這一類亞群腫瘤細(xì)胞不僅具有耐藥的能力，還具有自我更新、再生等干細(xì)胞特性，故被稱為腫瘤干/祖細(xì)胞〔2〕。故如何殺滅腫瘤干細(xì)胞成為治療腫瘤的關(guān)鍵。目前研究認(rèn)為miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用〔3〕。miR-21定位于17q23.2染色體FRA17B脆性區(qū)上，在肺癌〔4〕、肝癌〔5〕等多種組織、細(xì)胞中發(fā)揮促癌作用，但miR-21在腫瘤干細(xì)胞中的作用尚不清楚。本研究旨在探討miR-21對富含肺癌干細(xì)胞的A549細(xì)胞球增殖的影響以及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料 F12K培養(yǎng)基、胎牛血清、表皮生長因子(EGF), 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和opti-Mem購自Gibcol公司；B27、胰島素購自Sigma公司；APC標(biāo)記抗人CD133/1(AC133)抗體購自Miltenyi Biotec公司；FITC標(biāo)記抗人CD44抗體購自BD公司；TRIzol購自Invirogen公司；無血清培養(yǎng)基(SFM)：F12K+胰島素(4 U/L)+ B27(1倍)+ EGF(20 μg/L)+ bFGF(20 μg/L), 總RNA提取試劑盒購自東洋紡公司， HairpinitTMmiRNAs定量PCR試劑盒購自吉瑪公司。M-PER細(xì)胞裂解液購自賽默飛世爾公司。DKK2和β-catenin單克隆抗體均購自Abcam公司，β-actin購自北京天德悅公司。ribo FECTTM CP轉(zhuǎn)染試劑、miR-21抑制物、miR-21陰性對照物均購自廣州銳博公司。MTT試劑盒購自江蘇碧云天公司。

1.2方法

1.2.1肺癌A549細(xì)胞的培養(yǎng) A549細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基中，細(xì)胞置于37℃、5% CO2、飽和濕度下的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2A549細(xì)胞球的培養(yǎng) 將A549細(xì)胞以200個(gè)/孔接種到6孔板中，待其長成克隆后將其消化，置于含有適量SFM的超低黏附培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 w后觀察到細(xì)胞形成多細(xì)胞球體懸浮于培養(yǎng)基中，收集多細(xì)胞球體重置于胰蛋白酶中消化，將細(xì)胞球體吹散成為單細(xì)胞，離心洗滌后，接種于SFM中繼續(xù)培養(yǎng)，擴(kuò)增至第2代多細(xì)胞球體形成并應(yīng)用相關(guān)實(shí)驗(yàn)〔6〕。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞CD133+、CD44+的表達(dá) 收集107個(gè)細(xì)胞后用含有2% FBS的PBS重懸，3 000 r/min離心10 min后棄去上清，加入80 μl緩沖液后，加入10 μl CD133/L(AC133)抗體和20 μl CD44抗體，充分混勻后置于4℃避光孵育15～20 min。加入1 ml緩沖液后3 000 r/min離心10 min后棄去上清，加入200 μl 緩沖液重懸細(xì)胞后，上機(jī)檢測。

1.2.4實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為(1)A549細(xì)胞球組：未經(jīng)處理；(2) IHN組：miR-21抑制物轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞球；(3)IHN-NC組：miR-21抑制物陰性對照物轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞球。

1.2.5miR-21抑制物和陰性對照物的轉(zhuǎn)染 miR-21抑制物的序列為：5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′，為化學(xué)修飾的成熟miR-21互補(bǔ)單鏈。抑制物陰性對照物的序列為:5′-CAGUACUUUUGUAGUACAA-3′。將抑制物和陰性對照物干粉用RNase-free H2O 配制成20 μmol/L的儲(chǔ)存液后，分裝、凍存?zhèn)溆谩iR-21抑制物轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞的方法按照廣州銳博公司riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作：(1)將A549 sphere用胰酶消化，并將細(xì)胞球體吹散成為單個(gè)細(xì)胞，離心洗滌后用SFM重懸，在每孔含有440 μl SFM培養(yǎng)基的24孔板中接種約3×105個(gè)/孔細(xì)胞；(2)將5 μl 濃度為20 μmol/L 的miR-21抑制物加入到50 μl 1×riboFECTTMCP緩沖液中，輕輕混勻，室溫孵育5 min；(3)在上述混合液中加入5 μl轉(zhuǎn)染試劑ribo FECTTM CP Reagent，輕輕吹打混勻，室溫孵育15 min；(4)將60 μl轉(zhuǎn)染試劑-抑制物混合試劑加入含有細(xì)胞的孔板中，輕輕混勻，miR-21抑制物的轉(zhuǎn)染終濃度為200 nmol/L；(5)將培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2、飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行PCR和Western印跡檢測(MTT檢測的時(shí)間點(diǎn)為12、24、48 h)。miRNA-21陰性對照物組的轉(zhuǎn)染：取50 μl 1×riboFECTTMCP緩沖液稀釋1.25 μl 20 μmol/L miRNA 陰性對照物貯存液，余步驟同miR-21抑制物的轉(zhuǎn)染步驟。

1.2.6miRNA-21在細(xì)胞中的表達(dá)檢測 按照TRIzol提取總RNA試劑盒說明書提取細(xì)胞的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄條件為25℃ 30 min， 42℃ 30 min，85℃ 10 min，逆轉(zhuǎn)錄試劑由吉瑪公司提供。cDNA采用SYBR Seclect Master Mix系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-21的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參。引物序列見表1。每個(gè)待測基因設(shè)4個(gè)復(fù)孔。數(shù)據(jù)通過Sequence detection software 1.3系統(tǒng)進(jìn)行處理，按照公式RQ=2-△△CT計(jì)算各組間的倍數(shù)關(guān)系。

1.2.7Western印跡檢測DKK2和β-catenin 蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，加入300 μl M-PER細(xì)胞裂解液，置于冰上20 min，期間吹打多次，經(jīng)4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液。測濃度后，蛋白煮沸變性。制備SDS-PAGE凝膠，每孔加樣40 μg進(jìn)行電泳。250 mA濕轉(zhuǎn)86 min，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h后分別加入抗人DKK2(1∶300)、β-catenin (1∶1 000)及兔抗β-actin抗體(1∶10 000)的抗體稀釋液中4℃過夜，用TBST洗滌3次，5 min/次，后放入二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔，1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min，用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測DKK2、β-catenin、β-actin蛋白的表達(dá)水平。使用Image-Pro Plus10.0分析蛋白條帶圖片，，以同一標(biāo)本β-actin的產(chǎn)物光密度值作為內(nèi)參，校正各自目的蛋白的積分光密度值。

表1 引物序列

1.2.8MTT檢測細(xì)胞增殖 取生長良好的A549細(xì)胞球消化成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并將細(xì)胞濃度調(diào)整到3×103/孔，接種于96孔板后加入SFM培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后換液，每孔加入10 μl(5 mg/ml)的MTT溶液，孵育4 h后，每孔加入100 μl Formanzan溶液，繼續(xù)孵育直至顯微鏡下觀察到Formanzan全部溶解。用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(OD570 nm值)，空白孔調(diào)零。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS13.0進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1A549細(xì)胞球中CD133+CD44+的陽性率 流式細(xì)胞術(shù)檢測示A549細(xì)胞球中 CD133+CD44+的陽性率為65.800%。 A549細(xì)胞中CD133+CD44+的陽性率為0.577%。

2.2DKK2、β-catenin蛋白在A549細(xì)胞球和A549細(xì)胞中的表達(dá) DKK2蛋白在A549細(xì)胞球中的表達(dá)下調(diào)至A549細(xì)胞中的0.50±0.06倍(P<0.05)，而β-catenin蛋白在A549細(xì)胞球中的表達(dá)是A549細(xì)胞的1.72±0.06倍(P<0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測DKK2、β-catenin蛋白在A549細(xì)胞球和A549細(xì)胞中的相對表達(dá)

2.3免疫迎跡檢測不同處理?xiàng)l件下miR-21在A549細(xì)胞球以及A549細(xì)胞中的表達(dá) miR-21在A549細(xì)胞球組、IHN-NC組以及IHN組中的表達(dá)分別是A549細(xì)胞組的4.13±0.02、4.00±0.10、2.13±0.25倍(P<0.05)；A549細(xì)胞球轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后(IHN組)，miR-21的表達(dá)分別低至A549細(xì)胞球組、IHN-NC組的(51±6)%、(53±7)%，顯著低于A549細(xì)胞球組、IHN-NC組(P<0.05)；A549細(xì)胞球組與IHN-NC組的miR-21無顯著差異(P>0.05)。

2.4DKK2 蛋白在不同處理?xiàng)l件下A549細(xì)胞球中的表達(dá) A549細(xì)胞球轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后(IHN組)，DKK2蛋白的表達(dá)分別是A549細(xì)胞球組、IHN-NC組的2.13±0.20、2.06±0.16倍，顯著高于A549細(xì)胞球組、IHN-NC組(P<0.05)；A549細(xì)胞球組與IHN-NC組的DKK2蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。見圖2。

2.5β-catenin蛋白在不同處理?xiàng)l件下A549細(xì)胞球中的表達(dá) IHN組β-catenin蛋白的表達(dá)降低至A549細(xì)胞球組和IHN-NC組的(61±4)%、(59.8±5)%,顯著低于A549細(xì)胞球組、IHN-NC組(P<0.05)；A549細(xì)胞球組與IHN-NC組的DKK2蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。見圖3。

2.6不同處理時(shí)A549細(xì)胞球的抑制率 IHN組和IHN-NC組在12、24、48 h時(shí)抑制率顯著高于A549細(xì)胞球組(P<0.05)，IHN組在24、48 h時(shí)相點(diǎn)抑制率明顯高于IHN-NC組(P<0.05)。見圖4。

圖2 Western印跡檢測DKK2蛋白在A549細(xì)胞球不同處理?xiàng)l件下的相對表達(dá)

圖3 Western印跡檢測β-catenin蛋白在A549細(xì)胞球不同處理?xiàng)l件下的相對表達(dá)

與A549細(xì)胞球組比較：1)P<0.05；與IHN-NC組比較：2)P<0.05

3 討 論

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是腫瘤干細(xì)胞分化的結(jié)果，腫瘤干細(xì)胞對腫瘤的形成、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)起著關(guān)鍵作用〔7〕。腫瘤干細(xì)胞大多處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，使其對放化療并不敏感，導(dǎo)致大部分腫瘤難以治愈或復(fù)發(fā)。所以，治療腫瘤的關(guān)鍵在于對腫瘤干細(xì)胞的治療。本研究應(yīng)用無血清培養(yǎng)成功培養(yǎng)出A549細(xì)胞球。而Ye等〔8〕的研究認(rèn)為A549細(xì)胞球具有自我更新、更高增殖能力等肺癌干細(xì)胞的特性，為進(jìn)一步研究miR-21在肺癌干細(xì)胞中的作用奠定了基礎(chǔ)。

LI等〔9〕的研究指出在對EGFR酪氨酸激酶抑制藥物敏感的肺癌細(xì)胞PC9R中，miR-21的過表達(dá)可導(dǎo)致該細(xì)胞對EGFR酪氨酸激酶抑制藥物的耐受。而其他研究同樣證實(shí)miR-21在腫瘤細(xì)胞中的過表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤對化療藥物的耐受性〔10〕。上述研究提示miR-21在腫瘤中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究中miR-21在A549細(xì)胞球中的表達(dá)較A549細(xì)胞中顯著升高，提示miR-21在A549細(xì)胞球中發(fā)揮一定的作用。Yu 等〔11〕研究指出miR-21過表達(dá)可顯著增強(qiáng)結(jié)腸癌HT-116 干細(xì)胞球中過形成細(xì)胞球的能力以及在裸鼠皮下的成瘤能力，進(jìn)一步研究證實(shí)miR-21通過調(diào)控RECK、TIMP3等多個(gè)基因，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的侵襲、遷移和凋亡〔12〕。而在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，miR-21調(diào)控bcl-2等基因促進(jìn)腫瘤的生成〔13〕。Zhang 等〔14〕的研究指出在A549細(xì)胞中抑制miR-21的表達(dá)，可上調(diào)PTEN，導(dǎo)致A549細(xì)胞的凋亡增加和侵襲能力的降低。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后，A549細(xì)胞球的細(xì)胞抑制率顯著增高，提示miR-21可以調(diào)控A549細(xì)胞球的增殖。其調(diào)控A549細(xì)胞球的機(jī)制:(1)抑制miR-21，可上調(diào)其靶基因PTEN〔14〕、PDCD4(Programmed Cell Death4)〔15〕、TIMP3〔16〕等抑癌基因；(2)通過調(diào)控增殖相關(guān)信號(hào)通路。MiR-21可直接調(diào)控DKK2〔17〕，或通過作用于TGFβ2靶點(diǎn)調(diào)節(jié)TCF〔11〕等Wnt信號(hào)通路反應(yīng)元件，調(diào)控細(xì)胞增殖。

Dickkopf (DKK)是一種分泌蛋白，其家族有4種蛋白，主要作用是通過與Wnt受體LRP5/6及跨膜蛋白Keremen1/2結(jié)合，形成復(fù)合體并誘導(dǎo)細(xì)胞快速內(nèi)吞該復(fù)合體，以減少細(xì)胞膜上LRP5/6，阻斷Wnt信號(hào)從胞內(nèi)傳遞，抑制β-catenin入核發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)〔18〕。研究表明DKK2的缺失與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系〔19〕。本研究中當(dāng)A549細(xì)胞球轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后，DKK2蛋白表達(dá)上調(diào)，這與文獻(xiàn)〔17〕報(bào)道一致，提示DKK2可能是miR-21的靶點(diǎn)。在DKK2蛋白表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，β-catenin蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，說明DKK2抑制了Wnt信號(hào)通路，與文獻(xiàn)〔18〕報(bào)道一致。上述結(jié)果提示miR-21可能通過作用于靶點(diǎn)DKK2，調(diào)控Wnt信號(hào)通路，從而導(dǎo)致A549細(xì)胞球增殖能力的改變。

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