于學燕

(山東省胸科醫(yī)院腫瘤內科，山東 濟南 250013)

肺癌患者常因癌腫轉移或惡性侵襲而死亡，因此，如何減少肺癌惡性侵襲與癌腫的轉移成為臨床診治肺癌的研究熱點〔1〕。上皮型E-鈣黏蛋白(E-cadherin)在腫瘤的侵襲與轉移中起著重要作用〔2〕。Bcl-2/腺病毒E1B19 kD結合蛋白3(BNIP3)則通過促進線粒體水腫，影響腫瘤細胞能量代謝等線粒體途徑，從而促進腫瘤組織的凋亡〔3〕。缺氧誘導因子(HIF)-1α可在缺氧的環(huán)境中導致葡萄糖轉運蛋白1、血管內皮因子、促紅細胞生成素與碳酸酐酶9等基因的表達降低〔4〕。本研究利用免疫組化法與RT-PCR檢測方法，檢測E-cadherin、BNIP3、HIF-1α在老年肺癌組織中的表達與臨床意義。

1 資料與方法

1.1材料 75例肺癌組織采集于山東省胸科醫(yī)院腫瘤內科2010年1月至2013年8月住院患者存取的肺癌組織蠟塊，全部患者符合肺癌的臨床診斷標準，按世界衛(wèi)生組織(WHO)老年人劃分的新標準〔5〕為>60歲的高齡患者〔6〕。排除標準〔6〕：曾行免疫治療、化療與放療，具有手術禁忌證的患者。男57例，女 18例，其中小細胞癌13例，腺癌25例，支氣管肺癌14例，鱗癌23例；無淋巴結轉移28例，有淋巴結轉移47例；Ⅰ期33例，Ⅱ期32例，Ⅲ期8例，Ⅳ期2例。45例正常肺組織采集于癌旁遠處正常肺部組織并存檔蠟塊；8%～10%甲醛固定，石蠟，蘇木精-伊紅(HE)染色劑。

1.2試劑 免疫組化試劑盒，抗體，磷酸鹽緩沖液(PBS)配方，RT-PCR反應體系包括12.5 μl Master Mix(dNTP、DNA Polymerase、 緩沖液等試劑混合物)、0.4 μl上游引物、0.4 μl下游引物、10.7 μl去離子水、1 μl 模板；2%瓊脂糖凝膠。

1.3檢測方法

1.3.1免疫組化方法 (1)E-cadherin蛋白檢測：免疫組化試劑盒由Zymed公司提供,1%鼠抗人E-cadherin 抗體均由Zymed公司提供，嚴格按照試劑盒的操作規(guī)范，進行E-cadherin蛋白表達情況的測定；(2)BNIP3蛋白測定：BNIP3兔多克隆抗體由英國Abcam公司提供,切片脫水后進行微波加熱修復，放進pH6的緩沖液中，蓋上小孔蓋子，微波加熱直至沸騰，加熱修復液10～15 min，室溫下冷卻30 min后滴加PBS配方，室溫下放置20 min，PBS配方再次進行緩慢沖洗3次，約2 min/次，HE染色，樹膠固定，陽性切片作為肺癌組，PBS緩沖液配方作為單抗正常肺組織組。(3)2%兔抗人HIF-1α抗體由中國柏世德公司提供，嚴格按照試劑盒說明進行操作，PBS緩沖液作為陰性正常肺組織組。

1.3.2RT-PCR方法 通過RT-PCR方法進行E-cadherin 、BNIP3、HIF-1α mRNA檢測，標本速凍后冷存于-80℃中，按照TRIZOL試劑盒說明提取總mRNA，按照FRTS試劑盒說明進行cDNA轉錄合成操作，按照Primer 6.0設計PCR引物序列，在72℃～95℃中進行RT-PCR反應，常規(guī)瓊脂凝膠電泳分析，用Kodark 1D成像系統(tǒng)進行凝膠成像掃描，以β-actin作為對照。

1.4觀察指標

1.4.1蛋白表達評定 根據(jù)細胞質或細胞核呈現(xiàn)黃色作為陽性細胞的標準，觀察并記錄陽性細胞率與顯色強度，每張切片在400倍鏡中隨機采集5個視野，統(tǒng)計陽性細胞與癌腫細胞的比率作為陽性細胞率，按照陽性細胞率的大小進行0～4分的評分。根據(jù)染色程度進行顯色強度的評分。①陽性細胞率的評分標準：0分(0～5%)、1分(6%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)、4分(76%～100%)；②顯色強度評分標準：0分(染色與陰性組相同)、1分(淡黃色)、2分(接近深褐色)、3分(深褐色)。陽性細胞率與染色強度乘積作為免疫組化評分，評分在3分以上為陽性病例；由兩名病理醫(yī)生進行蛋白表達的評定。

1.4.2E-cadherin、BNIP3、HIF-1α蛋白表達相關性評價 根據(jù)高表達和低表達的分類標準〔5〕：免疫組化經(jīng)兩名病理醫(yī)生看過后均評為8分及其以上為高表達，評分在3～7分為低表達。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行分析，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，相關分析采用Spearman檢驗。

2 結 果

2.1E-cadherin、BNIP3、HIF-1α蛋白表達 肺癌組E-cadherin陽性表達率(62.67%，47例)顯著低于正常肺組織組(100.00%，45例)；肺癌組BNIP3、 HIF-1α陽性表達率(68.00%，51例；53.33%，40例)顯著高于正常肺組織組(均為6.67%，5例)(均P<0.05)。

2.2E-cadherin、BNIP3、HIF-1α mRNA表達 肺癌組織E-cadherin密度比值(1.51±0.38)顯著低于正常肺組織(3.16±0.51)，肺癌組織BNIP3、HIF-1α密度比值(1.48±0.37，1.19±0.29)顯著高于正常肺組織(0.21±0.04，0.22±0.05)(P<0.05)。見圖1。

A:肺癌組織;B:正常組織

2.3E-cadherin、BNIP3、HIF-1α蛋白表達的相關性 E-cadherin和BNIP3表達陽性率在肺癌組織中呈負相關(r=-0.37,P<0.05)；E-cadherin陽性率在肺癌組織中蛋白陽性表達率中呈負相關(r=-0.39,P<0.05)；BNIP3與HIF-1α表達陽性率在肺癌組織中陽性率呈正相關(r=0.41，P<0.05)。見表1。

表1 E-cadherin、BNIP3、HIF-1α蛋白表達的相關性(n)

2.4E-cadherin、BNIP3、HIF-1α表達與臨床病理特征的關系 E-cadherin的表達與肺癌的分化程度、臨床分期、淋巴轉移與組織學類型相關，主要表現(xiàn)為高分化、Ⅰ～Ⅱ型、無淋巴結轉移與支氣管肺癌的陽性表達率越高；BNIP3的表達與肺癌的分化程度、臨床分期、淋巴轉移與組織學類型等臨床病理因素均無關系；HIF-1α其中陽性與分化程度、臨床分期與組織學類型相關，主要表現(xiàn)為低分化、Ⅲ～Ⅳ期、鱗癌的HIF-1α的陽性表達率越高。見表2。

表2 E-cadherin、BNIP3、HIF-1α表達陽性率與臨床病理特征的關系〔n(%)〕

3 討 論

目前，肺癌的發(fā)生和轉移機制尚未完全明確，以致肺癌的臨床療效及預后均不理想。尤其對于老年患者來說，相關研究更為少見；腫瘤的侵襲與轉移是影響肺癌臨床療效及預后的重要因素之一〔7〕。在對其他腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤可形成間質性的浸潤，造成細胞黏附力的減弱，惡性腫瘤細胞通過血管與淋巴結進行全身各器官的轉移。E-cadherin是細胞黏附分子家族的成員，研究〔8〕表明，E-cadherin表達下降可造成細胞與細胞之間的黏附力下降，加速惡性腫瘤的轉移速度。BNIP3則是能與Bcl-2、E1B19k相結合的蛋白，定位與線粒體上，HIF-1α可使BNIP3呈現(xiàn)高表達，兩者共同作用下可使缺氧環(huán)境下的靶基因呈現(xiàn)更高表達。BNIP3的過表達可降低線粒體的功能導致正常細胞的死亡〔9〕；研究〔10〕表明，BNIP3通過降低抗凋亡蛋白的作用并以游離的狀態(tài)下自身激活增加線粒體的通透性，增加誘導凋亡因子的釋放造成正常細胞的死亡。多種研究〔11〕表明，BNIP3與HIF-1α的表達呈正相關，并在各種惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達。腫瘤組織必須抵抗缺氧微環(huán)境下不利于生存的環(huán)境，適應缺氧環(huán)境后可誘導新生血管的產生〔12〕，HIF-1α在缺氧環(huán)境下可存在一種轉錄因子，檢測腫瘤組織的HIF-1α可預測腫瘤微環(huán)境下的缺氧情況，另外，HIF-1α具有對各種血細胞生成素表達的調控作用，在惡性腫瘤的增殖、轉移與癌腫的血液支持中起著重要的作用，研究〔13〕證明：多種癌癥組織中均存在HIF-1α的高表達情況，可預測HIF-1α的表達與癌癥患者的預后關系密切。

E-cadherin、HIF-1α表達均與組織學類型、臨床分期等臨床病理因素密切相關，在肺癌組織中，E-cadherin呈低表達，BNIP3與HIF-1α呈高表達，E-cadherin與BNIP3、HIF-1α呈負相關，BNIP3與HIF-1α呈正相關，E-cadherin、BNIP3、HIF-1α的檢測均在診治與預測肺癌病情的嚴重程度中具有重要的臨床意義，而其相關機制仍需進一步探討。

4 參考文獻

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