單楊楊 李晟磊

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院老年病科，河南 鄭州 450052)

畸胎瘤衍生生長(zhǎng)因子 (Cripto)-1基因?qū)儆诒砥どL(zhǎng)因子Cripto -FRL-Criptic(EGF-CFC)基因家族成員，研究表明，Cripto-1蛋白在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，但在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，因此在一定程度上發(fā)揮著癌基因的作用。激活素(Activin)-A基因?qū)儆谵D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF) 的超家族成員，大量研究證實(shí)Activin-A對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，而在正常組織細(xì)胞中高表達(dá)，在一定程度上發(fā)揮著抑癌基因的作用。本研究探討這兩種基因蛋白對(duì)腫瘤臨床治療的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1材料 選擇2011年1月至2013年4月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)的肺腺癌患者石蠟包埋標(biāo)本47例，其中男29例，女18例，平均年齡(48.8±7.8)歲，其中無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例；按照肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期20例。結(jié)合2011年國(guó)際肺腺癌新分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)〔1〕，47例肺腺癌均為浸潤(rùn)性，具體又可分為：乳頭型20例、微乳頭型8例、實(shí)體型5例、腺泡型14例。對(duì)照組：選擇同期在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的正常肺組織石蠟包埋標(biāo)本25例，其中男11例，女14例，平均年齡(47.9±9.1)歲。

1.2免疫組化染色 染色方法按照免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化物酶(SP)法進(jìn)行操作。主要試劑：兔抗人Cripto-1多克隆抗體 (英國(guó)abcam公司)；羊抗人Activin-A多克隆抗體 (美國(guó)R&D公司)；封閉用正常羊血清、生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗、生物素標(biāo)記的兔抗山羊IgG、免疫組化顯色試劑盒(北京康為試劑公司)。

1.3結(jié)果判斷 Cripto-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，而Activin-A蛋白陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，兩者均以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜中呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。免疫組化結(jié)果評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：每張切片于顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，染色結(jié)果判定采用半定量加分法，即陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%計(jì)0分，5%～20%計(jì)1分，21%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分；②細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分，不著色計(jì)0分。將①和②所計(jì)分?jǐn)?shù)相加，≥3分為陽(yáng)性，<3分為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，免疫組化結(jié)果與臨床病理參數(shù)之間采用χ2檢驗(yàn)，Cripto-1與Activin-A兩者的相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Cripto-1蛋白在肺腺癌組織及正常肺組織中的表達(dá) Cripto-1在肺腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率〔72.3%(34/47)〕遠(yuǎn)高于其在正常肺組織中表達(dá)〔12.0%(3/25)〕(χ2=23.786，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

高表達(dá) 低表達(dá) 正常肺組織(陽(yáng)性)

2.2Cripto-1蛋白的表達(dá)與肺腺癌各項(xiàng)臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系 Cripto-1蛋白的高表達(dá)與肺腺癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肺腺癌的主要病理組織學(xué)分型具有密切相關(guān)性(P<0.05)。Cripto-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)在Ⅲ～Ⅳ期肺腺癌組織中較Ⅰ～Ⅱ期明顯升高，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽(yáng)性表達(dá)率遠(yuǎn)高于在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，并且Cripto-1蛋白在肺腺癌不同病理組織學(xué)分型標(biāo)本中的陽(yáng)性表達(dá)率也存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，其中在實(shí)體型和微乳頭型中的陽(yáng)性表達(dá)率遠(yuǎn)高于在乳頭型和腺泡型中的陽(yáng)性表達(dá)率，見(jiàn)表1。

2.3Activin-A蛋白在肺腺癌組織及正常肺組織中的表達(dá) Activin-A蛋白在肺腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率〔59.6%(28/47)〕遠(yuǎn)低于其在正常肺組織中的表達(dá)〔92.0%(23/25)〕(χ2=17.860，P<0.05)。見(jiàn)圖2。

陽(yáng)性 低表達(dá) 正常肺組織(高表達(dá))

表1 Cripto-1 蛋白及Activin-A蛋白陽(yáng)性表達(dá)與肺腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.4Activin-A蛋白的表達(dá)與肺腺癌各項(xiàng)臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系 Activin-A蛋白的低表達(dá)與肺腺癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肺腺癌的主要病理組織學(xué)分型密切相關(guān)(P<0.05)。Activin-A蛋白在肺腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽(yáng)性表達(dá)率遠(yuǎn)低于在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，在Ⅲ～Ⅳ期癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率較Ⅰ～Ⅱ期明顯降低，并且在實(shí)體型和微乳頭型中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于乳頭型和腺泡型(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.5Activin-A蛋白與Cripto-1蛋白在肺腺癌中表達(dá)的關(guān)系 在Activin-A陽(yáng)性表達(dá)的28例肺腺癌組織中，Cripto-1陽(yáng)性表達(dá)3例，陰性表達(dá)25例；在陰性表達(dá)的19例肺腺癌組織中，Cripto-1陽(yáng)性表達(dá)9例，陰性表達(dá)10例。Activin-A蛋白及Cripto-1蛋白在肺腺癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.418，P<0.05)。

3 討 論

不同類(lèi)型肺腺癌之間預(yù)后存在顯著差異，其中原位腺癌、微浸潤(rùn)性腺癌預(yù)后好，浸潤(rùn)性腺癌中貼壁型、乳頭型及腺泡型預(yù)后相對(duì)較好，而實(shí)體型和微乳頭型預(yù)后較差〔2，3〕。研究〔4〕表明，惡性腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞周期紊亂及增殖分化失調(diào)密切相關(guān)，而腫瘤的早期階段主要為細(xì)胞過(guò)度增生，繼而細(xì)胞增生調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。人們認(rèn)識(shí)到癌基因與抑癌基因的調(diào)節(jié)功能失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素。尋找癌基因、對(duì)相關(guān)癌基因的早期檢測(cè)及針對(duì)相關(guān)癌基因的分子靶向治療在腫瘤患者的治療中其作用越來(lái)越顯著，并且許多癌基因靶向分子已經(jīng)在多種不同的腫瘤中被鑒定〔5，6〕，癌基因靶向分子也成為近些年來(lái)醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。

Cripto-1基因蛋白具有癌基因特性，它在多數(shù)惡性腫瘤中的表達(dá)陽(yáng)性率大約從40%～80%不等，但對(duì)于肺腺癌中的表達(dá)卻鮮有報(bào)導(dǎo)。本研究顯示，肺腺癌組織中Cripto-1蛋白的高表達(dá)與肺腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。而且Cripto-1蛋白在肺腺癌的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用，Cripto-1蛋白的高表達(dá)也預(yù)示著肺腺癌的高惡性程度，預(yù)后不良。

Activin-A的信號(hào)通過(guò)ActivinⅠ型受體(Alk4)和ActivinⅡ型受體(ActRⅡ/ⅡB)來(lái)傳遞〔7〕。Activin-A是一種復(fù)雜的具有多種生物功能的激素，在人體多種正常組織細(xì)胞中表達(dá)，它的功能包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、分化、參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)甚至參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的過(guò)程〔8〕，因此被認(rèn)為是一種抑癌基因。激活素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的紊亂則可使細(xì)胞逃避由此介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制作用，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在以往的多項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，Activin-A可抑制多種腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)，但對(duì)于Activin-A與肺腺癌的相關(guān)性研究國(guó)內(nèi)外資料卻罕有報(bào)道。本研究顯示出在肺腺癌組織中Activin-A蛋白的低表達(dá)與肺腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，Activin-A蛋白的高表達(dá)預(yù)示著腫瘤的預(yù)后較好，因此在腫瘤的發(fā)生上Activin-A扮演著抑癌基因的作用。另外提示Activin-A蛋白的低表達(dá)在肺腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中同樣起著非常重要的作用，是肺腺癌預(yù)后不良的標(biāo)志。本研究還提示這二者在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著相互抑制的作用，相關(guān)研究表明，Cripto-1的促癌基因作用是通過(guò)調(diào)節(jié)Actvin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Cripto-1蛋白的過(guò)表達(dá)可阻礙細(xì)胞內(nèi)Activin-A 信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，Cripto-1可直接與Alk4結(jié)合，抑制Actvin-A與Alk4結(jié)合，在腫瘤細(xì)胞中，Activin的信號(hào)阻斷是由于形成了Cripto-1、Activin及 ActivinⅡ型受體(ActRⅡ)復(fù)合物〔9〕，繼而阻斷了Activin抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。此外，Cripto-1與Actvin-AB可直接結(jié)合從而達(dá)到阻斷Actvin-A抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。用Cripto-1的抗體抑制劑與ActvinA結(jié)合可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其抑制率可達(dá)到70%〔10〕，這為進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞的靶向治療提供了指導(dǎo)方向。針對(duì)Cripto-1研究最多的腫瘤生物靶向治療有：Cripto-1的反義寡核苷酸研究、RNA干擾技術(shù)及腫瘤單克隆抗體研究等。其中反義寡核苷酸研究在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)不僅能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)，還能降低腫瘤組織內(nèi)微血管的密度。RNA干擾技術(shù)是近年來(lái)研究出的較反義寡核苷酸技術(shù)更有望應(yīng)用于臨床治療的方法。目前國(guó)外研究最多的是針對(duì)Cripto-1分子結(jié)構(gòu)的兩個(gè)重要CFC和EGF研制出的單克隆抗體。針對(duì)Activin-A和Cripto-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的Cripto-1/ActRⅡ阻斷劑是最新研究的潛在的腫瘤靶向治療新方法，代表藥物阿蘭內(nèi)酯通過(guò)阻斷Cripto-1與ActivinⅡ型受體結(jié)合，阻斷Cripto-1信號(hào)的傳導(dǎo)來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用，相關(guān)資料顯示出該藥物在體外培養(yǎng)的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞中顯示出特異性抗腫瘤增殖的功能，而對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性〔9〕。此外，直接應(yīng)用Activin-A治療在一些腫瘤中能夠起到促進(jìn)腫瘤肌肉組織萎縮的作用，在小鼠體內(nèi)進(jìn)行Activin-A全身治療可起到促進(jìn)腫瘤組織肌肉萎縮和細(xì)胞凋亡的效果〔11〕。上述研究雖然因?yàn)槎喾N局限性暫不能應(yīng)用于人體內(nèi)研究，但為今后的臨床腫瘤靶向生物治療指出了新的方向。

4 參考文獻(xiàn)

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