張晉霞 張志勇 劉 斌 李世英 史富華 張 蕊

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 唐山 063000)

頸動(dòng)脈粥樣硬化特別是不穩(wěn)定性粥樣硬化斑塊的形成是腦梗死重要的病因和危險(xiǎn)因素，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組能降解細(xì)胞外基質(zhì)的鋅依賴(lài)性蛋白酶，MMP-1可以通過(guò)降解血管內(nèi)膜和粥樣斑塊纖維帽的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白促進(jìn)粥樣斑塊進(jìn)入不穩(wěn)定狀態(tài)，從而增加斑塊破潰、脫落和出血的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致腦梗死的發(fā)生〔1〕。MMP-1基因啟動(dòng)子區(qū)域在-519位點(diǎn)存在A/G單核苷酸多態(tài)性，可以對(duì)MMP-1的表達(dá)以及外周血MMP-1的水平有較大影響，導(dǎo)致其對(duì)粥樣斑塊有不同的作用程度，從而影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展〔2〕。本研究分析老年動(dòng)脈粥樣硬化腦梗死患者M(jìn)MP-1基因多態(tài)性和動(dòng)脈粥樣硬化程度的關(guān)系，從基因水平探究腦梗死的發(fā)病機(jī)制。

1 資料及方法

1.1一般資料 選取我院神經(jīng)內(nèi)科2011年6月至2013年6月期間收治的120例老年腦梗死患者，均經(jīng)頭部CT和MRI檢查，符合全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議中《各類(lèi)腦血管疾病診斷要點(diǎn)》中腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔3〕，并經(jīng)頸動(dòng)脈超聲檢查證實(shí)存在頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；排除外傷、藥物和腦血管畸形等其他原因?qū)е碌哪X梗死。根據(jù)頸動(dòng)脈超聲檢查結(jié)果分為不穩(wěn)定斑塊組60例和穩(wěn)定斑塊組60例。不穩(wěn)定斑塊組男性32例，女性28例，年齡49～77歲，平均(55．4±4.6)歲；穩(wěn)定斑塊組男性33例，女性27例，年齡48～74歲，平均(54．8±4.2)歲。另選取同期在本院接受體檢的健康者120例為對(duì)照組，其中男性64例，女性56例，年齡46～79歲，平均(53.6±5.6)歲，排除有心腦血管疾病史和腦梗死家族史。各組無(wú)血緣關(guān)系，性別、年齡以及吸煙、高血壓、高血脂、糖尿病等其他危險(xiǎn)因素?zé)o顯著性差異(P>0.05)。

1.2頸動(dòng)脈超聲檢查 采用HPSONOS 5500彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率設(shè)定為10 MHz。分別檢測(cè)雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸總動(dòng)脈分叉處(BIF)及頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)顱外段。測(cè)量并記錄頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中層厚度(IMT)、管壁內(nèi)徑和粥樣硬化斑塊回聲強(qiáng)度。診斷標(biāo)準(zhǔn)：IMT>1．2 mm為斑塊形成，而易損斑塊表面呈薄的高反射亮區(qū)，表面粗糙，有火山口樣龕影，偏心指數(shù)(斑塊厚度/對(duì)側(cè)IMT厚度)>2。

1.3外周血MMP-1水平檢測(cè) 觀察組和對(duì)照組分別于體檢后第2天和入院第2天清晨采集空腹靜脈血3 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定。

1.4聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)

1.4.1提取DNA 統(tǒng)一采集受檢者清晨2 ml靜脈血，于離心機(jī)中2 500 r/min離心10 min，丟棄上層血清，收集下層細(xì)胞沉淀。使用福州邁新生物技術(shù)公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒，采用低滲溶血、酚/氯仿法從白細(xì)胞中抽提DNA，適量雙蒸水溶解，核酸分析儀測(cè)定DNA濃度，并在-70℃的環(huán)境中保存留作備用。

1.4.2PCR 引物序列由上海生物工程服務(wù)有限公司合成，上游引物為5′-AGGACTACAGGTGCATGACT-3′,下游引物為5′-CACAGGTCAAAGAGTACTCC-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μl，包括TaqDNA聚合酶0.25 μl，10×PCR緩沖液2.5 μl，上、下游引物各為1 μl，dNTP混合物2 μl、模板DNA 1 μl，不足部分的體積用滅菌蒸餾水補(bǔ)足到25 μl。置于熱循環(huán)儀(Bio-Rad)中95℃預(yù)變性5 min， 按照：95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s的步驟循環(huán)30次，末次循環(huán)后，72℃延伸5 min。

1.4.3RFLP分析 PCR產(chǎn)物以限制性?xún)?nèi)切酶KpnⅠ(上海生物工程服務(wù)有限公司)酶切消化。酶切反應(yīng)體系為20 μl：PCR產(chǎn)物17 μl、10×PCR緩沖液2 μl、KpnⅠ酶1 μl。將酶切體系置于37℃保溫箱溫育16 h，終止反應(yīng)。將酶切產(chǎn)物在12%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后EB染色，判斷電泳結(jié)果并攝片。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.4統(tǒng)計(jì)軟件，按Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)樣本的群體代表性，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MMP-1基因-519A/G基因型分析 經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為469 bp，依據(jù)限制性?xún)?nèi)切酶KpnⅠ酶切片段的結(jié)果可將其基因型分為三種：AA純合型(238、231 bp，因?yàn)閮善伍L(zhǎng)度相差僅7 bp，瓊脂糖凝膠電泳不能分辨，故只顯示一條帶)、AG雜合型(469、238、231 bp，兩條帶，原因同上)、GG純合型(469 bp，1條帶)。

2.2各組血清MMP-1含量比較 梗死組MMP-1血清含量〔(1.39±0.33)μg/L〕明顯高于對(duì)照組〔(0.83±0.04)μg/L〕(t=18.45,P<0.05)；不穩(wěn)定斑塊組和穩(wěn)定斑塊組外周血MMP-1濃度比較〔(1.40±0.36) vs (1.38±0.34)μg/L〕差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.31,P>0.05)。

2.3各組MMP-1基因型及等位基因分布頻率比較 MMP-1基因 -519A/G的基因型在兩組中的分布頻率，經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，符合遺傳平衡的標(biāo)準(zhǔn)，滿(mǎn)足群體代表性。梗死組和對(duì)照組均存在AA、AG、GG三種基因型，且AA基因型及A等位基因在梗死組中的分布頻率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。不穩(wěn)定斑塊組和穩(wěn)定斑塊組MMP-1基因-519A/G位點(diǎn)基因型、等位基因頻率分布有顯著差異(P<0.05)。AA基因型以及A等位基因在不穩(wěn)定斑塊組中的分布頻率明顯高于穩(wěn)定斑塊組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組MMP-1基因型及等位基因分布頻率比較〔n(%)〕

3 討 論

腦梗死的發(fā)病與遺傳和環(huán)境均有重要關(guān)系，許多與之有關(guān)的基因如與血脂代謝相關(guān)的基因和MMPs基因逐步被發(fā)現(xiàn)〔4〕。目前認(rèn)為MMPs基因多態(tài)性可能與頸動(dòng)脈粥樣硬化程度相關(guān)，并通過(guò)相關(guān)機(jī)制影響腦梗死的發(fā)病。

頸動(dòng)脈粥樣硬化是腦梗死的重要危險(xiǎn)因素，不僅因?yàn)閯?dòng)脈粥樣斑塊造成的動(dòng)脈狹窄使遠(yuǎn)端腦組織呈低灌注狀態(tài)導(dǎo)致腦梗死，還因?yàn)樵趧?dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中，斑塊性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化，可能發(fā)生破潰、脫落而使遠(yuǎn)端血管栓塞，或者因血小板和凝血因子被斑塊暴露的脂質(zhì)和膠原纖維激活而啟動(dòng)凝血反應(yīng)，形成血栓而引發(fā)腦梗死〔5〕。所以任何引起頸動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性發(fā)生改變的因素都可能使腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白是粥樣硬化斑塊纖維帽的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是組成血管內(nèi)膜的主要蛋白，對(duì)維持粥樣硬化斑塊纖維帽和血管內(nèi)膜的完整性有至關(guān)重要的作用〔6〕。MMP-1的主要作用即為降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白，因此其與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性有密切的關(guān)系。

MMP-1是MMPs家族中表達(dá)最多的腸膠原酶，主要由成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等分泌。MMPs家族是一個(gè)依賴(lài)鋅、鈣離子的蛋白水解酶家族，其主要作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)，還具有促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和移行以及促進(jìn)血管生成的作用〔7，8〕。在創(chuàng)傷愈合、修復(fù)及重構(gòu)等病理過(guò)程中，MMPs表達(dá)量會(huì)明顯升高，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中，MMPs也有重要作用。MMPs根據(jù)底物親和力的不同主要分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解素、膜型MMPs四類(lèi)，MMP-1即屬于膠原酶的一種。MMP-1基因定位于11q22，與其他MMPs家族的基因及兩個(gè)假基因緊密連鎖，全長(zhǎng)8 244 bp，由9個(gè)內(nèi)含子和10個(gè)外顯子組成，其編碼的MMP-1能夠降解間質(zhì)膠原如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型膠原〔9〕。MMP-1基因?qū)倏烧T導(dǎo)表達(dá)基因，在活躍的生理性或病理性組織重構(gòu)中表達(dá)水平明顯升高。MMP-1基因啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，如在-1607位點(diǎn)存在1G/2G單核苷酸多態(tài)性，在-519位點(diǎn)存在A/G單核苷酸多態(tài)性。研究發(fā)現(xiàn)-519位點(diǎn)位于基因啟動(dòng)子的保守區(qū)域，該區(qū)域單核苷酸多態(tài)性可影響轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，從而影響MMP-1基因轉(zhuǎn)錄，使MMP-1表達(dá)水平改變〔10〕。

綜上，腦梗死的發(fā)病與遺傳和環(huán)境均有重要關(guān)系，MMP-1基因-519A/G多態(tài)性與腦梗死的發(fā)病和頸動(dòng)脈粥樣硬化程度相關(guān)，其中AA基因型和A等位基因可能會(huì)降低頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性，增加腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。但腦梗死發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，并且MMP-1基因型的分布和種族及地域有關(guān)，因此，MMP-1基因-519A/G多態(tài)性與腦梗死的發(fā)病和頸動(dòng)脈粥樣硬化程度的相關(guān)性仍需大量研究證實(shí)。

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