帥智峰 劉 婷 于秀文 溫秋婷 王玉樓

(齊齊哈爾醫(yī)學院病理學系，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

卵巢癌浸潤轉(zhuǎn)移是治療失敗和患者死亡的重要原因，迄今還沒有滿意的治療方法。鋅指蛋白SNAI1是胚胎發(fā)育中促進中胚層和神經(jīng)嵴形成的非常重要的轉(zhuǎn)錄因子。SNAI1通過抑制E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生，導致癌細胞喪失上皮特性，富于侵襲和轉(zhuǎn)移特性〔1〕。目前尚無關于SNAI1在卵巢腫瘤中表達的比較研究。本研究用免疫組織化學檢測83例卵巢囊腺瘤、不同分化程度的卵巢癌組織中SNAI1 和E-cadherin的表達情況，探討SNAI1在卵巢癌中表達的意義。

1 材料和方法

1.1標本來源 收集齊齊哈爾醫(yī)學院病理診斷中心2008年9月1日至2011年3月1日存檔的卵巢上皮性腫瘤組織標本，共83例。全部病例由病理專家復診并依據(jù)最新《WHO腫瘤病理學和遺傳學分類》進行病理組織學分類及分期。其中卵巢囊腺瘤33例，高分化卵巢癌35例，低分化卵巢癌15例。患者年齡23～ 68歲，中位年齡49歲，術前均未接受化療和放療。所有組織10% 福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚切片， 免疫組織化學二步法進行檢測。

1.2試劑 SP法檢測試劑盒和E-cadherin 鼠抗人多克隆抗體購自北京中杉公司；SNAI1兔抗人多克隆抗體購自美國U S Biological公司；人卵巢癌細胞系HO8910購自中科院上海生物科學研究所細胞庫；重組腺病毒表達載體pAdEasy-SNAⅡ由我校藥物研究所協(xié)助構建。

1.3SP法檢測SNAI1、E-cadherin的表達 免疫組織化學方法按試劑盒說明書操作。SNAI1抗體的工作濃度為1∶200，E-cadherin抗體的工作濃度時1∶50，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液抗原修復，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固，PBS取代一抗作陰性對照。

1.4結果判斷標準

1.4.1SNAI1 細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。①強度分數(shù)標準：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。②隨機選擇10個高倍視野，每個視野計算100個腫瘤細胞，共計數(shù)1 000個腫瘤細胞，計算陽性細胞百分率：1%～<25%為1分，25%～<50%為2分，50%～<75%為3分，≥75%為4分。兩項得分相乘，4～7分為“+”，8～11分為“”，滿12分為“”，“+～”為陽性表達。

1.4.2E-cadherin 在細胞膜及少許細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。按著色強度及范圍分為4級：陽性細胞數(shù)0～10%為“-”，陽性細胞數(shù)>10%～ 50%為“+”,陽性細胞數(shù)>50%～ 90% 為“”,陽性細胞數(shù)>90%為“”。

1.5重組腺病毒表達載體pAdEasy-SNAI1 感染HO8910人卵巢癌細胞 HO8910細胞接種到6孔板培養(yǎng)至80%～90%融合，更換新鮮培養(yǎng)基進行重組腺病毒轉(zhuǎn)染。實驗組每孔加入10 μl pAdEasy-SNAI1病毒濃縮液，對照組加入10 μl空載腺病毒pAdEasy-GFP 濃縮液。轉(zhuǎn)染72 h后,檢測目的蛋白表達水平，確認轉(zhuǎn)染效率。

1.6Western印跡法檢測HO8910細胞SNAI1蛋白，上皮性標記物E-cadherin和間葉標記物Vimentin的表達 細胞裂解緩沖液裂解HO8910細胞提取總蛋白，取等量蛋白質(zhì)進行凝膠電泳分離，分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并以5%脫脂奶粉封閉2 h。加入1∶500 稀釋兔抗人SNAI1蛋白多克隆抗體、小鼠抗人E-cadherin單克隆抗體及1∶300 稀釋小鼠抗人Vimentin單克隆抗體、小鼠抗人β-actin 單克隆抗體。4℃過夜后,加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠、羊抗兔二抗(1∶2 000 稀釋)，37℃ 孵育2 h，PBS液洗膜后暗室內(nèi)加Western Blue顯影。

1.7劃痕實驗檢測HO8910細胞的運動能力 將轉(zhuǎn)染目的基因后的HO8910細胞接種到6 孔板中，待細胞單層鋪滿后，10 μl移液器槍頭在6 孔板中劃線，劃痕面積約為10 mm×1 mm，無菌PBS洗去細胞碎屑，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分時段觀察，于0、12、24、48 h在倒置顯微鏡下照相。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行Kruskal-Wallis Test和Spearman相關分析。

2 結 果

2.1SNAI1 表達情況 免疫組化結果顯示，SNAI1表達主要定位在細胞核內(nèi)(圖1)，呈彌漫分布。SNAI1在卵巢囊腺瘤、高分化卵巢癌及低分化卵巢癌組織的表達明顯不同(χ2=50.496，P=0.000;χ2=15.051，P=0.014)，以低分化卵巢癌中的表達最強。見表1。

2.2E-cadherin 表達情況 E-cadherin在胞膜上呈均質(zhì)、連續(xù)線狀表達，E-cadherin在卵巢囊腺瘤、高分化卵巢癌、低分化卵巢癌組織的表達明顯不同(χ2=32.949，P=0.000;χ2=14.489，P=0.029)，見表1，圖2。

表1 SNAI1、E-cadherin在卵巢囊腺瘤、高分化卵巢癌和低分化卵巢癌中的表達(n=83)

卵巢囊腺癌 高分化卵巢癌 低分化卵巢癌

卵巢囊腺癌 高分化 卵巢組織

2.3SNAI1、E-cadherin相關性分析 在卵巢囊腺瘤、高分化卵巢癌及低分化卵巢癌組織的中的SNAI1與E-cadherin的表達呈顯著負相關關系(r=-0.342,P=0.000)。

2.4過表達SNAI1對HO8910細胞上皮/間葉標記物表達的影響 Western印跡法檢測蛋白水平：以兔抗人SNAI1蛋白多克隆抗體作為檢測抗體，檢測SNAI1蛋白在HO8910細胞中的表達，實驗組SNAI1蛋白表達水平顯著增強,明顯高于對照組(P<0.01),實驗組E-cadherin較對照組表達水平顯著降低，Vimentin表達水平增高見圖3，表2。

表2 SNAI1、E-cadherin、Vimentin在HO8910細胞中的表達情況

圖3 Western印跡法檢測SNAI1、E-cadherin、Vimentin在HO8910細胞中的表達

2.5過表達SNAI1對HO8910細胞運動能力的影響 細胞劃痕后每12 h倒置顯微鏡下進行1次觀察照相，各時間點轉(zhuǎn)染pAdEasy-SNAI1的HO8910細胞劃痕愈合速度均快于對照組,實驗組細胞運動能力更強,運動速度更快。見圖4。

A對照組；B實驗組

3 討 論

SNAI1是鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子超家族，它受到多種信號通路的調(diào)控，是參與EMT調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子。SNAI1誘導的EMT過程在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、細胞分化、細胞遷移、腫瘤轉(zhuǎn)移等生理、病理過程中起重要作用〔2〕。目前，普遍認為SNAI1通過誘導EMT過程促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，在腫瘤轉(zhuǎn)移的初期階段發(fā)揮重要作用。

SNAI1是snail超家族中最早被發(fā)現(xiàn)的，該家族由一個高度保守的羧基末端及一個高度可變的氨基末端構成，其家族成員在結構上的差異主要表現(xiàn)在中間P-S富集區(qū)域。同時snail的二級結構包括兩個β-折疊、一個α-螺旋和一個DNA連接凹槽，DNA連接凹槽可特異性的與含6個核心堿基(CAGGTG/CACCTG)的結合位點結合，該結合位點被稱為E-box〔3〕。Larue等〔4〕描述，在中胚層與神經(jīng)嵴的前體中，SNAI1通過下調(diào)E-cadherin而觸發(fā)上皮細胞向間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變，E-cadherin是負責細胞上皮表型如細胞極性、細胞和基質(zhì)的黏附能力的主要成分。SNAI1通過與E-cadherin啟動子區(qū)域的E-box結合，直接抑制E-cadherin表達，誘導EMT發(fā)生。

Blanco等〔5〕報道乳腺癌組織中SNAI1表達與腫瘤病理分級和淋巴結轉(zhuǎn)移相關。類似的報道還見于對胰腺癌和結直腸癌和肝癌的研究中〔6～8〕。本研究免疫組化結果提示通過檢測卵巢癌的SNAI1水平，可以作為卵巢癌惡性程度和估計預后的指標。

SNAI1通過直接抑制E-cadherin的表達促進EMT的發(fā)生。發(fā)生EMT的細胞主要表現(xiàn)為細胞極性的喪失、細胞變梭、伸出絲狀偽足并獲得侵襲運動能力；在分子生物學方面則表現(xiàn)為上皮標志物缺失或減弱，如E-cadherin，而獲得間質(zhì)標志物，如Vimentin的表達增加〔9，10〕。E-cadherin 是細胞黏附分子鈣黏蛋白家族中的重要成員，廣泛分布于上皮細胞中，E-cadherin是負責細胞上皮表型如細胞極性、細胞和基質(zhì)的黏附能力的主要成分。目前認為E-cadherin 表達丟失是EMT 最顯著特征〔11〕。

本研究證實轉(zhuǎn)錄因子SNAI1在促進卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的病理生理過程中發(fā)揮了重要的作用，SNAI1有可能成為卵巢癌治療的有效靶點。

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