齊鳳杰 劉 廷 姚 萍 趙樹鵬

(遼寧醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧 錦州 121001)

14-3-3σ是一種特異性上皮細(xì)胞因子,被認(rèn)為是腫瘤抑制基因,與腫瘤關(guān)系最為密切〔1〕。研究顯示,多種腫瘤細(xì)胞中14-3-3σ基因的CpG島發(fā)生高頻率甲基化,使14-3-3σ基因沉默或低表達(dá),造成G2期檢控點(diǎn)損傷,使基因缺陷積累,從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化〔1〕。本研究通過采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)法(MSP)對(duì)浸潤(rùn)性乳腺癌患者癌組織及相應(yīng)癌旁組織進(jìn)行14-3-3σ甲基化檢測(cè)，RT-PCR法檢測(cè)14-3-3σ mRNA轉(zhuǎn)錄,探討在浸潤(rùn)性乳腺癌中14-3-3σ甲基化與轉(zhuǎn)錄的關(guān)系,為尋找乳腺癌的特異性腫瘤標(biāo)志及為乳腺癌的早期診斷提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病例材料 選取2010年5月至2011年4月遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)2位以上病理醫(yī)師確診的浸潤(rùn)性乳腺癌組織標(biāo)本73例?；颊呔鶠榕裕挲g27～79歲，中位年齡48歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療及內(nèi)分泌治療，按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)2003年TNM分期：Ⅰ期患者22例、Ⅱ期31例、Ⅲ期20例；根據(jù)2003年世界衛(wèi)生組織(WHO)乳腺癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類：非特殊型浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌40例、浸潤(rùn)性小葉癌10例、特殊型浸潤(rùn)性乳腺癌23例,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例。另取同一患者的癌旁>5 cm處乳腺組織73例作對(duì)照。新鮮癌組織及癌旁組織均凍存于-80℃冰箱用于提取DNA及RNA。

1.2試劑 DNA甲基化修飾試劑盒購(gòu)自EPIGENTEK公司，基因組DNA提取試劑盒、Trizol、RT-PCR試劑盒、Hot Start Taq DNA聚合酶、L1000TMDNA Marker均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1RNA提取和cDNA合成 50 mg組織剪碎后,按照Trizol說明書從乳腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織中提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA。取總RNA 1 μg，按反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行cDNA鏈合成，置于-20℃保存。

1.3.2DNA提取 每例新鮮標(biāo)本均按照說明書進(jìn)行DNA提取，最后加入適量滅菌水溶解基因組DNA。核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定DNA濃度和OD值。取DNA溶液2 μl加3 μl 6×Loading Buffer，1%瓊脂糖凝膠電泳(80 V電壓，50 min)，紫外燈下觀察，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照。其余DNA溶液均-80℃凍存。

1.3.3DNA的甲基化修飾 每例DNA標(biāo)本取1 μg按試劑盒說明書進(jìn)行修飾，在初步去鹽，脫磺酸基后，加12 μl R6溶液到這個(gè)離心管里過濾，1 2000 r/min離心20 s來洗脫修飾的DNA，終濃度約為40 ng/μl，-80℃凍存；經(jīng)此修飾后，DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)被去氨基和磺化，轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)。

1.3.4MSP 14-3-3σ基因MSP和非甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(USP)上下游引物均由大連寶生物工程有限公司合成，引物序列參考文獻(xiàn)〔2〕設(shè)計(jì)如表1；配制PCR反應(yīng)液前，先把盛放修飾后DNA的EP管簡(jiǎn)單離心，避免殘留的試劑接觸PCR反應(yīng)管(此步重要)。PCR反應(yīng)體系20 μl：其中Hot Start Taq酶(5 U/μl)0.2 μl，10×PCR Buffer(Mg2+Plus)3 μl，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)2 μl，甲基化修飾后的DNA模板1 μl，上下游引物各1 μl(20 μmol/L)，滅菌蒸餾水11.8 μl。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s,65℃(M)或59℃(U)退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5 min。滅菌蒸餾水代替模板DNA做陰性對(duì)照。瓊脂糖凝膠電泳：取擴(kuò)增產(chǎn)物20 μl加3 μl 6×Loading Buffer， 2%瓊脂糖凝膠電泳(110 V電壓，40 min)。DL1000TMDNA Marker每次取10 μl直接電泳。凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.5RT-PCR反應(yīng) 14-3-3σ基因和作為內(nèi)參照的β-actin基因引物設(shè)計(jì)均由大連寶生物工程有限公司合成，引物序列參考文獻(xiàn)〔3〕設(shè)計(jì)。20 μl反應(yīng)體系包括1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄所獲得的cDNA、5×RT Buffer(含Mg2+)4 μl、d NTPs 1 μl 、10 μmol/L的上下游引物各1 μl、TaKaRa Taq HS0.2 μl、超純水9.8 μl。見表2。

PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃30 s，37個(gè)循環(huán)，72℃延伸4 min。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)。分析浸潤(rùn)性乳腺癌14-3-3σ啟動(dòng)子甲基化與基因表達(dá)間關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。

表1 浸潤(rùn)性乳腺癌14-3-3σ基因甲基化特異性PCR引物

表2 浸潤(rùn)性乳腺癌14-3-3σ基因RT-PCR引物

2 結(jié) 果

2.1基因組DNA的提取及電泳結(jié)果 1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：基因組DNA條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象。核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定其濃度及OD值，滿足進(jìn)一步DNA修飾的實(shí)驗(yàn)要求。見圖1。

1～3：癌旁乳腺組織；4～7：浸潤(rùn)性乳腺癌組織

1,3,5：甲基化PCR產(chǎn)物；2,4,6：未甲基化PCR產(chǎn)物；M：DL1000 DNA Marker

2.2MSP檢測(cè)結(jié)果 MSP檢測(cè)結(jié)果分為甲基化、未甲基化和部分甲基化3種(見圖2)，其中部分甲基化的病例歸為甲基化統(tǒng)計(jì)。73例浸潤(rùn)性乳腺癌和癌旁乳腺組織中，甲基化的檢出率分別為54.79%(40/73)和23.29%(17/73),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.225，P<0.05)。甲基化在105 bp處出現(xiàn)條帶，非甲基化在107 bp處出現(xiàn)條帶。

2.3RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 73例浸潤(rùn)性乳腺癌組織中有53例表達(dá)缺失，缺失率為72.6%。癌旁正常組織中14-3-3σ基因的表達(dá)缺失15例，缺失率為20.55%，明顯低于浸潤(rùn)性乳腺癌組織(χ2=39.748，P<0.05)。14-3-3σ在247 bp處出現(xiàn)條帶，內(nèi)參β-actin在520 bp處出現(xiàn)條帶。見圖3。

1～4：浸潤(rùn)性乳腺癌，5～7：乳腺癌旁組織M：DL 1 000 DNA Marker

2.4浸潤(rùn)性乳腺癌14-3-3σ基因啟動(dòng)子的甲基化與臨床病理特征的關(guān)系 浸潤(rùn)性乳腺癌14-3-3σ基因甲基化檢出率與TNM分期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER受體等分組間差異均有顯著性意義(P<0.05)，與其他臨床特征之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 浸潤(rùn)性乳腺癌14-3-3σ基因啟動(dòng)子的甲基化與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.573例浸潤(rùn)性乳腺癌14-3-3σ基因啟動(dòng)子甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系 在40例14-3-3σ基因啟動(dòng)子CpG島發(fā)生異常甲基化的浸潤(rùn)性乳腺癌組，均未檢測(cè)到14-3-3σ的mRNA表達(dá)；而33例非甲基化組，有25例表達(dá)，表達(dá)率為75.76%，應(yīng)用Spearman相關(guān)分析14-3-3σ基因啟動(dòng)子甲基化和基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.676,P=0.000)。

3 討 論

14-3-3蛋白,是一組高度保守且?guī)缀踉谒姓婧松锛?xì)胞中都有表達(dá)的蛋白質(zhì)家族,具有多種生物學(xué)功能〔4〕:參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、凋亡、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞骨架構(gòu)建及離子通道的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制等。14-3-3σ抑癌基因定位于1p35,在細(xì)胞周期信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著重要作用,是G2細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的基因家族成員,為CDK抑制因子,負(fù)責(zé)DNA的損傷修復(fù),故被認(rèn)為是細(xì)胞周期檢查點(diǎn)基因。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3σ基因甲基化異常改變與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系極為密切,有較高的甲基化頻率〔5，6〕。在Ferguson等〔7〕研究中，對(duì)48例原發(fā)性乳腺癌組織標(biāo)本進(jìn)行14-3-3σ mRNA檢測(cè)，結(jié)果只有3例表達(dá),且表達(dá)缺失率與其甲基化直接相關(guān)。乳腺癌細(xì)胞株經(jīng)過5-氮雜胞苷藥物處理后，14-3-3σ基因發(fā)生去甲基化,又重新轉(zhuǎn)錄表達(dá)。故首次提出乳腺癌的轉(zhuǎn)錄表達(dá)缺失與基因甲基化密切相關(guān)，說明14-3-3σ基因的甲基化是其轉(zhuǎn)錄缺失的重要原因。Yang等〔5〕報(bào)道，14-3-3σ蛋白在原發(fā)性乳腺癌中處于低表達(dá)狀態(tài),增加乳腺癌細(xì)胞14-3-3σ的表達(dá)可以抑制腫瘤的發(fā)生。14-3-3σ蛋白主要表達(dá)于上皮組織,通過細(xì)胞周期蛋白CDKS復(fù)合物的磷酸化作用而參與細(xì)胞周期調(diào)控,抑制細(xì)胞進(jìn)入增殖周期,阻止分裂,促進(jìn)終末分化,最終誘導(dǎo)其凋亡。呂軍等〔8〕發(fā)現(xiàn)散發(fā)性乳腺癌中14-3-3σ基因有較高的甲基化率(90%)，其甲基化與乳腺癌的組織分型、組織分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系，且浸潤(rùn)性癌甲基化率高于原位癌,可能由于14-3-3σ基因甲基化程度的增加,造成其轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)或缺失,從而導(dǎo)致了乳腺癌的進(jìn)展。因此,認(rèn)為14-3-3σ高甲基化頻率可能預(yù)示著甲基化是使該基因失活的重要方式之一。本研究檢測(cè)結(jié)果說明14-3-3σ基因甲基化很可能是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生的一個(gè)條件。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),不同的實(shí)驗(yàn)組,研究結(jié)果有所不同。分析原因,甲基化率的高低與甲基化實(shí)驗(yàn)條件和標(biāo)本的選取關(guān)系密切。Ferguson 等〔7〕在退火溫度為56℃，31個(gè)循環(huán)條件下,檢測(cè)到14-3-3σ基因在乳腺癌組織標(biāo)本中甲基化率達(dá)91%，標(biāo)本選取都經(jīng)過顯微切割技術(shù)處理,以保證標(biāo)本腫瘤成分的純度。呂軍等〔8〕實(shí)驗(yàn)研究顯示，14-3-3σ基因在散發(fā)性乳腺癌組織標(biāo)本中甲基化率也為90%，反應(yīng)條件為58℃，30～35個(gè)循環(huán)。鐘政榮等〔9〕采用60℃退火溫度，35個(gè)循環(huán)條件,檢測(cè)到14-3-3σ基因在散發(fā)性乳腺癌中甲基化率為85%。我們是在65℃退火溫度，35個(gè)循環(huán)條件下得出甲基化率為66.17%。以上研究和本實(shí)驗(yàn)均采用相同的甲基化引物〔8〕。所有研究都顯示14-3-3σ基因在乳腺癌中甲基化率很高,為其成為乳腺癌診斷的腫瘤標(biāo)記物提供可能,但應(yīng)用于臨床尚需規(guī)范與標(biāo)準(zhǔn)化。

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7Ferguson AT，Evron E，Umbr icht CB,etal.High frequency of hypermethylation at the 14-3-3 sigma locus leads to gene silencing in breast cancer〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2000；97(11)：6049-54.

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