朱 江 高燕軍 竇志杰 米艷娟 孫艷軍 龍雅君 韓玉敏

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

神經(jīng)生長因子(NGF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)可以明顯促進(jìn)缺血后神經(jīng)元的存活和生長發(fā)育，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)，促進(jìn)受損神經(jīng)元再生及分化成熟，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)過程中具有重要的作用〔1〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，BDNF和NGF對于新生血管亦有誘導(dǎo)和促進(jìn)形成的作用〔2〕。依達(dá)拉奉是一種新型腦保護(hù)劑，具有清除自由基和神經(jīng)保護(hù)作用〔3〕,可抑制腦細(xì)胞的過氧化作用和延遲神經(jīng)元死亡，并減輕腦缺血和腦缺血引起的腦水腫和組織損傷〔4〕。本研究從依達(dá)拉奉對大鼠缺血腦組織中NGF和BDNF表達(dá)的改變及其最終對微血管分布的影響的角度，對依達(dá)拉奉在腦缺血過程中起到的保護(hù)作用進(jìn)行深入的探討。

1 材料與方法

1.1動物與分組 60只Wistar成年健康雄性大鼠，220～240 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。隨機(jī)分為假手術(shù)組，治療組，缺血對照組。按時間點(diǎn)分為7、14 d兩個亞組，其中假手術(shù)組每個亞組6只，其余每個亞組12只。

1.2方法

1.2.1腦缺血模型制備 結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈：10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg),仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌，暴露分離出雙側(cè)頸總動脈并結(jié)扎切斷，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。電凝椎動脈：大鼠俯臥固定，于后正中線第1頸椎水平處作縱形切口，沿中線分開肌層，暴露第1頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入右側(cè)橫突孔內(nèi)凝閉椎動脈3～4 s，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。待清醒后，單籠保溫喂養(yǎng)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動物的干預(yù)方法 假手術(shù)組只暴露雙側(cè)頸總動脈及右側(cè)椎動脈，不做血管阻斷處理。治療組、缺血對照組均在阻斷雙側(cè)頸總動脈及右側(cè)椎動脈后立即開始治療。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射依達(dá)拉奉2次/d，時間間隔12 h，每次注射計(jì)量按3 mg/kg計(jì)算，到術(shù)后7、14 d兩個時間點(diǎn)分別處死，取中腦腦組織。缺血對照組腹腔注射生理鹽水2次/d，時間間隔12 h，注射劑量為0.5 ml/次。到術(shù)后7、14 d兩個時間點(diǎn)分別處死，取中腦腦組織。

1.2.3實(shí)驗(yàn)標(biāo)本制作 應(yīng)用10%水合氯醛 (350 mg/kg)，腹腔注射。仰臥位固定于鼠板上，快速剪開腹腔和胸腔的前壁，清晰的暴露出心臟，用連有輸液管的預(yù)先處理為鈍圓的針頭插入左心室內(nèi)，快速輸入溫生理鹽水(37℃)100 ml，同時用眼科剪剪破右心耳，此時血液由右心耳處流出，待大鼠四肢末端變白，換上4%多聚甲醛〔0.1 mol磷酸鹽緩沖液(PBS)配成pH 7.4〕灌流固定。灌流結(jié)束后取出腦組織，用冰生理鹽水沖洗，除去血液。石蠟包埋切片。

1.2.4觀察指標(biāo) ①微血管密度：每只大鼠取3張切片，采用Simple PCI-8圖像分析軟件分析腦組織微血管灰度。每張切片在光鏡下選5個視野，取平均灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。該分析儀器的灰度級為0～256灰級，平均灰度表示陽性細(xì)胞的反應(yīng)強(qiáng)度，平均灰級越高，說明反應(yīng)強(qiáng)度越低。②神經(jīng)營養(yǎng)因子：NGF、BDNF蛋白表達(dá)的測定用SP免疫組織化學(xué)染色法，所有切片染色均采用相同條件，每批染色均設(shè)陰性對照。陰性對照用PBS替代一抗孵育切片。結(jié)果判定：陽性細(xì)胞的胞漿、胞膜、軸突呈棕黃色著色。圖像分析：用Simple PCI-8圖像分析軟件對圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每張切片在光鏡下選5個視野，取平均灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。該分析儀器的灰度級為0～256灰級，平均灰度表示陽性細(xì)胞的反應(yīng)強(qiáng)度，平均灰級越高，說明反應(yīng)強(qiáng)度越低。

2 結(jié) 果

2.1各組腦組織中NGF、BDNF灰度值的變化 通過對7、14 d后實(shí)驗(yàn)動物的觀察，治療組及缺血對照組中灰度值較假手術(shù)組顯著增加。但是，治療組NGF、BDNF灰度值增加的程度低于缺血對照組。其中，治療組各時段NGF、BDNF灰度值均低于缺血對照組。與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

2.2各組腦組織中微血管灰度的變化 通過對7、14 d后實(shí)驗(yàn)動物的觀察，治療組及缺血對照組的微血管灰度值較假手術(shù)組均增加。治療組數(shù)值增加的幅度低于缺血對照組。其中，治療組微血管灰度值在各時段均低于缺血對照組。與假手術(shù)組相比較二者均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦組織中NGF、BONF蛋白陽性表達(dá)灰度值及微血管灰度值比較±s)

3 討 論

腦缺血后，腦神經(jīng)元損傷的程度與BDNF和NGF的表達(dá)水平密切相關(guān)〔5,6〕。腦缺血后，BDNF、NGF均增加〔7〕，通過拮抗興奮性氨基酸毒性，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度；增強(qiáng)抗氧化酶活性，減輕自由基損傷；抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)蛋白酶活性；修復(fù)受損神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元再生機(jī)制〔8〕提高神經(jīng)元的抗損傷能力〔9〕。

在腦缺血后，出現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)量及微血管密度的減少，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加。在缺血條件下，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量增生填充于壞死區(qū)域，引起局部微循環(huán)障礙，即微血管凋亡的數(shù)量大于其新生的數(shù)量。研究發(fā)現(xiàn)BDNF參與內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)解，與血管新生有關(guān)。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子，對神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育、損傷修復(fù)有重要作用〔10〕。有研究證實(shí)，100 μg/L的BDNF體外促內(nèi)皮細(xì)胞血管新生能力與25 μg/L血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)相當(dāng)，為一種新的促血管新生因子〔11〕。在體外促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長，在體內(nèi)誘導(dǎo)血管的發(fā)生。

依達(dá)拉奉是目前臨床上廣泛使用的自由基清除劑，可通過血腦屏障，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕腦組織花生四烯酸引起的腦水腫，縮小缺血半暗帶的面積，抑制遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞的死亡，還可以防止血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。依達(dá)拉奉清除自由基，提高BDNF、NGF水平，進(jìn)一步影響血管新生數(shù)量。

本研究提示依達(dá)拉奉不僅具備清除自由基的作用，還可以通過激發(fā)NGF途徑對神經(jīng)元起到保護(hù)作用。更重要的是，微血管密度增加可從根本上改善腦組織缺血造成的損傷。同時提示微血管密度增加可促進(jìn)NGF、BDNF的表達(dá)，NGF又進(jìn)一步刺激微血管新生，即二者之間是相互促進(jìn)的正性刺激過程。

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