劉怡菲 褚昀赟 岑暢飛 劉先哲

(三峽大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 宜昌 443002)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)作為強(qiáng)大的促纖維化細(xì)胞因子，與平滑肌細(xì)胞(SMCs)上受體結(jié)合活化胞內(nèi)Smad信號(hào)通路，刺激細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成〔1〕，增加動(dòng)脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性。Smad泛素調(diào)節(jié)因子2(Smurf2)是泛素連接酶E3 HECT家族成員，其能干擾TGF-β1細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典的Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中多個(gè)環(huán)節(jié)阻斷TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔2〕，從而減弱 TGF-β1纖維化作用。雖然Raines等〔3〕腎纖維化疾病中研究發(fā)現(xiàn)在腎小管上皮細(xì)胞中TGF-β1促進(jìn)Smurf2基因和蛋白的表達(dá)水平，但在血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)中二者之間的關(guān)系尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)選擇以動(dòng)脈粥樣硬化為背景，研究在VSMCs中TGF-β1對(duì)Smurf2的作用，探討不同濃度TGF-β1對(duì)Smurf2以及其后續(xù)產(chǎn)物ECM中Ⅰ型膠原(ColⅠ)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠VSMCs A7r5(中科院上海細(xì)胞庫(kù))。低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FCS)(美國(guó)Gibco)，TGF-β1(廣州奕源生物科技有限公司)，胰蛋白酶-EDTA(武漢博士德生物工程有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TAKARA公司)，GoTaq GreenMaster Mix(美國(guó)Promega),TRIzol(上海華舜)，Smurf2引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，兔抗大鼠Smurf2抗體(美國(guó)Santa Cruz公司),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中山公司)，大鼠ColⅠ ELISA試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) A7r5用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5% 二氧化碳(CO2)恒溫條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。隨機(jī)分為：對(duì)照組(不含干預(yù)因素的正常培養(yǎng)的細(xì)胞)、TGF-β1(1、5、10 μg/L)3種濃度分別刺激24 h，每組均為4瓶細(xì)胞。

1.2.2RT-PCR法檢測(cè)A7R5細(xì)胞中Smurf2 mRNA的表達(dá)量 根據(jù) Trizol RNA說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)GenBank內(nèi)的序列，采用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物，序列如下：Smurf 2引物：正鏈 5′-GGG AAC GCC CAA CAA GAC-3′，反鏈 5′-ATT GCG GAT CTC CCA CCC-3′，368 bp；β-actin正鏈：5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′，反鏈：5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′，375 bp，逆轉(zhuǎn)錄條件按說(shuō)明書(shū)操作即可。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min、94℃變性35 s、56℃復(fù)性35 s，72℃延伸45 s條件擴(kuò)增30次。72℃補(bǔ)充延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以1 000 bp DNA梯度標(biāo)記上樣作為分子量標(biāo)記；以UVP凝膠圖像掃描系統(tǒng)測(cè)目的基因與β-actin吸光度A比值，設(shè)對(duì)照組為1，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Western印跡檢測(cè)Smurf2蛋白的表達(dá) 用4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3次，加入300 μl含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液，置于冰上30 min，收刮細(xì)胞，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。各組取50 μg待測(cè)蛋白質(zhì)樣本，與蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品共同進(jìn)行SDS-PAGE電泳，聚丙酰胺的積層膠濃度為5%，分離膠濃度為8%，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置5%脫脂奶粉封閉緩沖液中37℃ 60 min，TBS漂洗后分別加入兔抗大鼠Smurf 2抗體(1∶500)，4℃過(guò)夜用TBS漂洗，充分洗膜后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶3 000)37℃ 60 min，然后用TBS漂洗，ECL法顯色，X光膠片曝光顯影。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4ELISA測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物上清中ColⅠ的表達(dá) 提取細(xì)胞上清液，10 000 r/min離心10 min除顆粒和聚合物，將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，用ELISA定量測(cè)定ColⅠ的濃度,按說(shuō)明書(shū)操作即可。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TGF-β1對(duì)大鼠VSMCs Smurf2 mRNA水平的影響 對(duì)照組有一定量的Smurf2 mRNA表達(dá)(0.264 8±0.008 74)，用TGF-β1(1、5、10 μg/L)分別刺激大鼠VSMCs 24 h后， Smurf2 mRNA的表達(dá)明顯減弱(0.240 5±0.009 42、0.180 8±0.014 83、0.131 4±0.007 43)，分別下降9.177%、31.722%和50.378%，且呈劑量依賴性，與對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

1：對(duì)照組； 2：TGF-β1(1 μg/L)； 3：TGF-β1(5 μg/L)； 4：TGF-β1(10 μg/L)，下圖同

2.2TGF-β1對(duì)大鼠VSMCs Smurf2蛋白表達(dá)的影響 對(duì)照組有一定量的Smurf2蛋白表達(dá)，用TGF-β1(1、5、10 μg/L)刺激大鼠VSMCs 24 h后， Smurf2蛋白的表達(dá)均明顯降低，與對(duì)照組比較，分別下降了14.78%、18.63%和35.28%(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度TGF-β1作用下Smurf2和內(nèi)參蛋白免疫印跡結(jié)果

2.3TGF-β對(duì)大鼠VSMCs ColⅠ表達(dá)的影響 不同濃度TGF-β1作用于大鼠VSMCs 24 h后，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中ColⅠ蛋白的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)：同對(duì)照組相比，不同濃度TGF-β1作用下ColⅠ蛋白表達(dá)量均升高，分別是對(duì)照組的1.276 8、121.448 5和1.635 5倍(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖3 Ⅰ型膠原標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討 論

既往的研究表明VSMC，是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中最主要的細(xì)胞成分，各種生長(zhǎng)因子對(duì)VSMC，轉(zhuǎn)型、增殖的調(diào)節(jié)已成為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)〔4〕。Stefroni等〔4〕通過(guò)做血透發(fā)現(xiàn)伴有冠心病的患者血中TGF-β1水平明顯低于無(wú)冠心病的患者，血TGF-β1水平每降低1 μg/L，心血管疾病相關(guān)威脅性增加9%，表明TGF-β1水平降低是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立威脅因子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1是強(qiáng)大的催纖維化因子，可刺激VSMCs產(chǎn)生ECM，增加纖維帽厚度〔1〕。這些研究結(jié)論與本研究結(jié)果是一致的。

Smurf2是C2-WW-HECT 結(jié)構(gòu)域的E3 泛素連接酶家族的一員，在多種生物過(guò)程中扮演重要角色。Smurf2能干擾TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多個(gè)重要環(huán)節(jié)阻斷其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔5〕。高表達(dá)的Smurf2能降低TGF-βRI的表達(dá)水平〔6〕，最近研究表明TGF-βRⅡ也可以被Smurf2降解〔7〕。Smurf2能與Smad 2的脯-酪氨酸(PPXY)序列緊密結(jié)合,通過(guò)HECT結(jié)構(gòu)域催化降解Smad 2。雖然Smad4分子的序列中沒(méi)有PPXY模序,當(dāng)Smurf2與I-Smad共同存在時(shí),Smad 4與Smad 7通過(guò)各自的MH2區(qū)相結(jié)合,由Smad7介導(dǎo)其多泛素化而降解〔8～12〕。Smurf2通過(guò)對(duì)TGF-β1胞內(nèi)Smad通路精細(xì)復(fù)雜地調(diào)節(jié)影響其細(xì)胞外基質(zhì)的合成，在維持動(dòng)脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性中起重要作用。

本研究結(jié)果顯示TGF-β1可抑制VSMCs中Smurf2的表達(dá)，促進(jìn)ColⅠ的表達(dá)。TGF-β1作為動(dòng)脈粥樣硬化中的保護(hù)因子，隨濃度的升高逐漸促進(jìn)ColⅠ的產(chǎn)生，與以往文獻(xiàn)報(bào)道相符〔1，13〕，并隨濃度依賴性抑制Smurf2表達(dá)，由此推斷在VSMCs中，TGF-β1提高其信號(hào)強(qiáng)度，增加ECM的產(chǎn)生，抑制Smurf2的表達(dá)可能是其作用機(jī)制的一種。

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