李德來 鄧為民 李宏釗

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津 300070)

肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)高度表達(dá)于平滑肌細(xì)胞，是平滑肌細(xì)胞收縮調(diào)節(jié)的限速蛋白。在相應(yīng)信號機(jī)制激動下，MLCK被磷酸化后激活肌球蛋白球部的ATP酶，觸發(fā)ATP水解為肌細(xì)胞收縮提供能量，從而導(dǎo)致肌肉收縮。此外，MLCK還可以通過非激酶方式觸發(fā)平滑肌收縮。有研究表明MLCK可對腫瘤細(xì)胞增殖調(diào)控起重要作用，近年研究又表明MLCK在慢性缺氧導(dǎo)致的肺血管平滑肌收縮中起重要作用〔1〕，但MLCK對平滑肌細(xì)胞增殖的影響目前尚不清楚。本研究旨在通過研究闡明MLCK在平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及其可能涉及的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 新生SD大鼠(約4周齡)購自貴州大學(xué)實驗動物中心。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶〔含0.5%乙二胺四乙酸(EDTA)〕及磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Gibico公司；8肽膽囊收縮素(CCK-8)細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所(Dojindo)；兔抗大鼠α-肌動蛋白單克隆抗體購自Abcam公司；真核表達(dá)及病毒包裝所需元件購自Addgene，引物及shRNA片斷由Invitrogen公司負(fù)責(zé)合成；RNA抽提試劑Trizol及PCR檢測試劑均購自日本寶生物公司。

1.2肺動脈血管平滑肌細(xì)胞(VMSC)培養(yǎng) 處死大鼠后，以75%酒精擦拭大鼠以消毒，分離并取出肺動脈后將之置于無菌PBS內(nèi)，沖凈血液并去除結(jié)締組織，最后將肺動脈剪成1 mm3左右大小組織塊置于培養(yǎng)瓶內(nèi)于37℃孵育2 h。取出培養(yǎng)瓶并加入含10% FBS及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，再次置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3～5天換液1次，直至細(xì)胞從組織塊周圍長出。最后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)。使用平滑肌α-肌動蛋白染色并鑒定其純度。

1.3載體構(gòu)建及病毒包裝 為從基因水平上調(diào)控MLCK表達(dá)，本研究擬采用病毒介導(dǎo)MLCK過表達(dá)或shRNA干擾方法進(jìn)行。使用高保真PCR酶擴(kuò)增大鼠MLCK編碼序列(CDS序列)全長，并于起始啟動子前添加Kozak序列以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后連接至慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1α-copGFP，最后使用psPAX2及pMD2.G包裝慢病毒后轉(zhuǎn)染VMSC，以PCR方法檢測MLCK上調(diào)情況。全部引物見表1。將shRNA溶解并置20 ρmol于20 μl退火緩沖液(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA及200 mmol/L NaCl)中，以PCR儀以1為單位進(jìn)行梯度降溫，每個溫度維持1 min，最后取出產(chǎn)物即為退火完全的shRNA，經(jīng)非變性聚丙稀酰胺凝膠(PAGE)瓊脂糖電泳證實該方法可將shRNA徹底退火成雙鏈。將上述退火后的shRNA與酶切后的miRZip載體連接，篩選出正確重組子后按上述方法包裝慢病毒并轉(zhuǎn)導(dǎo)VSMC。

1.4VSMC增殖檢測 使用內(nèi)皮素(ET)-1誘導(dǎo)VSMC增殖，以CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒檢測不同MLCK表達(dá)水平對VSMC增殖的影響，觀察MLCK表達(dá)水平對VSMC增殖的影響。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 計量資料組間比較采用t檢驗。

表1 本研究中所使用PCR引物及shRNA序列

2 結(jié) 果

2.1慢毒包裝及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效果 本研究過程中已使全部VSMC帶上外源基因(圖1)。RT-qPCR結(jié)果及Western印跡結(jié)果亦顯示MLCK被顯著上調(diào)或抑制(圖2)。

2.2MLCK水平改變對VSMC增殖和ETA-R的影響及Rho激酶在其中的作用 過表達(dá)MLCK可直接導(dǎo)致VSMC增殖能力增強(qiáng)，而且還進(jìn)一步增殖被ET-1刺激的VSMC增殖；而抑制MLCK可減弱VSMC增殖能力并抑制ET-1導(dǎo)致的VSMC增殖。見圖2。RT-qPCR(PVSMC-miRNA Zip組：0.83±0.21，PVSMC-shRNA組：0.27±0.03，P<0.05)及Western印跡(PVSMC-COPgfp組：0.78±0.17，PVSMC-MLCK組：15.08±2.65，P<0.05)結(jié)果均顯示MLCK表達(dá)升高可導(dǎo)致VSMC ETA-R升高，ET-1刺激下可加劇這種改變；而下調(diào)MLCK表達(dá)可抑制ETA-R表達(dá)，并抑制ET-1帶來的ETA-R表達(dá)水平增加。

2.3MLCK對ETA-R的作用與Rho激酶作用的關(guān)系 Rho激酶抑制劑Fasudil可減弱MLCK及ET-1升ETA-R的作用。ET-1、ET-1+MLCK、ET-1+shRNA、ET-1+MLCK+FASUDIL組OD值分別為0.71±0.14，0.89±0.16，0.34±0.04，0.58±0.07，見圖3。

圖1 PVSMC明場(A)和PVSMC-pCDH-MLCK-copGFP熒光(B)

A.免疫印跡顯示MLCK被顯著上調(diào)或下調(diào)；B.RT-qPCR結(jié)果與免疫印跡結(jié)果一致

圖3 MLCK對PVSMC表達(dá)ETA-R增殖的作用

3 討 論

本研究采用慢病毒操縱基因表達(dá)的方法，證實了MLCK在VSMC增殖中的作用。結(jié)果表明，MLCK表達(dá)升高可促進(jìn)VSMC增殖及上調(diào)ETA-R表達(dá)水平，進(jìn)一步研究還表明，MLCK的這種作用可能是通過其對Rho激酶的激活實現(xiàn)的。

肺動脈高壓的重要發(fā)生機(jī)制之一是平滑肌收縮。MLCK在平滑肌收縮中的作用已有多量報道。經(jīng)典理論認(rèn)為，MLCK通過使用MLC磷酸化觸發(fā)局部Mg2+-ATP酶活性，從而引發(fā)肌肉收縮〔2〕。在隨后針對MLCK研究歷程中，學(xué)者發(fā)現(xiàn)MLCK以非激酶方式調(diào)節(jié)平滑肌收縮〔3〕。但無論MLCK以何種方式進(jìn)行調(diào)節(jié)及發(fā)揮作用，結(jié)果均一致認(rèn)為隨著MLCK增加，肌絲運(yùn)動速度增強(qiáng)，平滑肌收縮增強(qiáng)。

在肺動脈高壓中，除平滑肌收縮外，平滑肌增殖參與血管重塑及平滑肌對縮血管物質(zhì)的反應(yīng)也是決定肺動脈高壓進(jìn)展的重要因素〔4〕。然而，盡管MLCK在平滑肌收縮研究中已得到充分研究，其在平滑肌增殖中的作用至今尚未見報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MLCK可促進(jìn)VSMC增殖并促進(jìn)ETA-R表達(dá)。鑒于VSMC增殖及ET-1在肺動脈高壓中的重要作用，本研究結(jié)果提供了MLCK調(diào)節(jié)肺動脈高壓的機(jī)制，可能為肺動脈高壓防治帶來更多思路。

Rho激酶在肺動脈高壓中的作用日益得到重視，大量研究認(rèn)為Rho激酶激動劑對肺動脈高壓有益，且目前已成為肺動脈高壓干預(yù)靶點之一〔5〕，且MLCK與Rho在平滑肌收縮中的相互作用已被報道〔6〕。本研究結(jié)果顯示，Rho激酶抑制劑至少可部分抵消MLCK的激活VSMC增殖及增強(qiáng)ETA-R表達(dá)作用。盡管其機(jī)制未明，但這提示Rho激酶這一已在肺動脈高壓中得到證實的關(guān)鍵酶可能參與MLCK調(diào)節(jié)肺動脈高壓的機(jī)制中。目前，尚無證據(jù)顯示MLCK能調(diào)節(jié)Rho激酶活性；同時，鑒于MLCK及Rho激酶對平滑肌收縮作用的同向性，Rho激酶作為一放大效應(yīng)分子而非MLCK直接調(diào)節(jié)目標(biāo)的可能性仍不能排除，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步證實提供更多證據(jù)。

4 參考文獻(xiàn)

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2Kirschstein T，Protzel C，Porath K，etal.Age-dependent contribution of Rho kinase in carbachol-induced contraction of human detrusor smooth muscle in vitro〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2014;35(1):274-81.

3梁明麗，崔 穎，呂廣艷，等.肌球蛋白輕鏈激酶非激酶活性調(diào)節(jié)磷酸化肌球蛋白ATP酶活性及肌絲運(yùn)動〔J〕.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2008；35(1)：91-6.

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6Kogata N，Tribe RM，F(xiàn)assler R，etal.Integrin-linked kinase controls vascular wall formation by negatively regulating Rho/ROCK-mediated vascular smooth muscle cell contraction〔J〕.Genes Dev，2009；23(19)：2278-83.