田 偉 王效杰

(沈陽醫(yī)學(xué)院解剖教研室，遼寧 沈陽 110034)

細(xì)胞與材料的相互作用是組織工程研究的重要內(nèi)容〔1〕，種子細(xì)胞的功能有賴于細(xì)胞外基質(zhì)的存在〔2〕。目前，皮膚組織工程研究的熱點(diǎn)之一在于尋找理想的支架材料。因?yàn)槠洳粌H影響種子細(xì)胞的生物學(xué)特性和培養(yǎng)效率，而且決定組織工程皮膚移植后能否適應(yīng)受體并與之結(jié)合，實(shí)現(xiàn)修復(fù)皮膚缺損的目的。小腸黏膜下層(SIS)是近年來利用物理和化學(xué)的方法處理而得到的無細(xì)胞的天然細(xì)胞外基質(zhì)〔3，4〕，其結(jié)構(gòu)與皮膚十分相似，但是其孔徑率和孔徑大小并不利于種子細(xì)胞長入。本實(shí)驗(yàn)利用化學(xué)-物理-材料力學(xué)的方法對SIS進(jìn)行改建，以骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，體外進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，通過觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在SIS上的生長情況，確定SIS的生物相容性，為利用SIS作為支架材料構(gòu)建組織工程皮膚提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 Wistar大鼠10只，雌雄不限。豬小腸由河北省薊州肉食加工公司購買。胃蛋白酶和1-Ethyl-3-EDC由sigma公司購買。TritonX- 100由美國圣路易斯化工有限公司購買

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1豬SIS的準(zhǔn)備 小腸用清水沖洗干凈后, 采用文獻(xiàn)2的方法處理得到無細(xì)胞的SIS。

1.2.2豬SIS海綿的制備 將準(zhǔn)備好的SIS 用剪刀剪成1 cm2大小的組織塊，放入含有0.2%的胃蛋白酶3%的乙酸水溶液，SIS以不同的1～4wt%濃度配比，在37℃磁力攪拌器中攪拌72 h，等到SIS充分溶解以后，倒入培養(yǎng)皿中，冷凍24 h后，在冷凍干燥機(jī)中24 h，將所得的SIS海綿剪成直徑在1 cm圓形，放入12孔的培養(yǎng)板中，分成三組，用含有50、100和150 mmol/L EDC的體積比為95∶5酒精水溶液進(jìn)行交聯(lián)24 h，然后取出在40℃的水浴中反復(fù)沖洗，取出未反應(yīng)的SIS,再次冷凍干燥，并使用環(huán)氧乙烷消毒(沈陽市中心醫(yī)院)，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?〕。

1.2.3豬SIS海綿的形態(tài)學(xué)觀察 (1)蘇木素-伊紅(HE)染色：取SIS海綿，大小1 cm×2 cm，石蠟常規(guī)切片，做HE染色，以SIS為對照。(2)掃描電鏡觀察： SIS海綿置于預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液內(nèi)，浸泡12 h，取出樣品塊放入0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS)(pH7.2)中過夜，系列梯度酒精脫水，醋酸異戊酯置換，二氧化碳臨界點(diǎn)干燥，真空噴金，JSM-T300掃描電鏡觀察并攝片，以SIS為對照。(3)孔徑大小的測量：取HE染色的石蠟切片，共9組，每組隨機(jī)抽取10個(gè)切片，每個(gè)切片4個(gè)視野，用Luzex-F實(shí)時(shí)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算孔徑大小及孔徑率，以SIS為對照。(4)吸水率的測定：用20 ml去離子水浸泡0.05 g的100 nm的1wt%～4wt%的SIS海綿 ,每組5個(gè)樣品，每24 h將多余的水分吸去，直至燒杯中無肉眼可以鑒別的水分，測量浸泡前后重量的變化，連續(xù)5 d，計(jì)算水的吸收能力由方程W =( F- 0.05/0.05)×100%,其中，W是SIS海綿的吸水率， F是浸泡后SIS海綿的重量，然后計(jì)算平均值。(5)SIS海綿降解率的測定：將一定質(zhì)量的支架材料浸入在含0.1%胃蛋白酶的3%乙酸溶液中，60 min后，待材料吸收了充分的溶液后稱重記為W1，放置在37℃水浴振蕩器中，維持溫度并同時(shí)對其震蕩，每隔24 h，取出支架材料，用濾紙將材料表面的液體擦干，稱重記為W2，支架材料的降解率為：D= (W1-W2)/W1×100%，每個(gè)樣品測3個(gè)樣，求其平均值。

1.2.4BMSCs復(fù)合SIS海綿的形態(tài)學(xué)觀察 (1)BMSCs的培養(yǎng)：取昆明小白鼠20只，雌雄不限，1月齡，體重約18 g，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，無菌條件下暴露股骨，去除干凈附帶的肌肉和骨膜，取中段股骨，用加入肝素的PBS液進(jìn)行沖洗，沖洗液加入10 ml離心管中1 000 r/min 10 min離心，棄上清，加3 ml DMEM培養(yǎng)基(LG)進(jìn)行吹打，接種于20 ml培養(yǎng)瓶，加入5 ml DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2，37℃，飽和濕度的CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)，2 d后進(jìn)行首次換液以去除混雜的血細(xì)胞和單核細(xì)胞，以后每2天換液，每日倒置鏡下觀察，2 w后細(xì)胞長滿單層，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取一部分細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色及光、電鏡觀察。(2)BMSCs和SIS海綿的聯(lián)合培養(yǎng)、取第2代的BMSCs，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.1×104/ml,加入預(yù)先準(zhǔn)備的12孔培養(yǎng)板中，讓每孔中SIS海綿充分潤濕，置于5%CO2，37℃飽和濕度的CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)， 6 h后更換培養(yǎng)液，以后每2 d換1次液，聯(lián)合培養(yǎng)1、2、3 w后，分別將復(fù)合物取出。部分以10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，行HE染色。部分標(biāo)本以2.5%戊二醛固定，做掃描電鏡觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS11，軟件進(jìn)行分析，差異顯著性采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1肉眼、HE染色 肉眼觀察SSIS呈海綿狀，韌性強(qiáng)，光鏡下顯示呈蜂窩狀，結(jié)構(gòu)較規(guī)整，沒有極性，孔隙分布均勻，內(nèi)部和外部的結(jié)構(gòu)一致，沒有分層現(xiàn)象。見圖1，圖2。

2.2掃描電鏡觀察 SIS濃度升高，出現(xiàn)了孔徑大小和密度的變化，在2wt%時(shí)孔徑大小約為100～150 μm，但是隨著SIS濃度增加，孔徑逐漸下降，而且結(jié)構(gòu)出現(xiàn)松散的現(xiàn)象。見圖3。

2.3SIS海綿孔徑大小的測量 冷凍干燥法制備的SIS海綿為多孔連通性分布，1wt%組的平均孔徑為100～150 μm，而2wt%組支架平均孔徑為150～200 μm,其他各組的孔徑在逐漸下降。此外，以2wt%組的支架，各層之間的連接多為較細(xì)的似纖維的結(jié)構(gòu)，造成整個(gè)支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)較粗糙，而對于以1wt%組的支架，各層之間的連接多光滑，材料內(nèi)部的相對粗糙度較小，不利于細(xì)胞的黏附，而且1wt%、2wt%組和3wt%、4wt%組的差異顯著(P<0.05)。見表1 。

圖1 SIS海綿和單層SIS膜的比較

圖2 SIS海綿的HE染色(以SIS對比,×40)

圖3 100 mmol/L組1wt%SIS海綿的電鏡特點(diǎn)(×500)

表1 不同濃度的EDC 100 nm的SIS海綿的孔徑短軸大小的兩兩比較

2.4吸水率的測定 在去離子水中浸泡1～5 d的100 nm EDC不同的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SIS海綿組，不同濃度的SIS海綿中，1wt%的吸水能力比2wt%高出均2倍，吸水率均數(shù)為0.654 1 vs 0.485 4；但是其他兩組的吸水能力和2wt%的區(qū)別不是特別明顯，3wt%、4wt%組吸水率均數(shù)分別為0.366 8、0.331 7。結(jié)構(gòu)顯示，1wt%的結(jié)構(gòu)更加利于水分的流動(dòng)和變化，而且和PBS對比沒有大的區(qū)別，但是4wt%組吸水力已經(jīng)沒有明顯的改變。

2.5SIS海綿降解率的測定 各組材料從外形上看，5 d時(shí)，每組支架都有不同程度的降解，1wt%、2wt%組均保持了原有的外觀，但是其他兩組，尤其4wt%組變化明顯，各組材料1wt%組與其他3組比較差異顯著(P<0.05)；各組支架在第2天時(shí)降解速度較快，特別是按4wt%比例制備的材料，在第5天就已降解約30%，其余三組各組間進(jìn)行比較差異顯著 (P<0.05)，支架材料的降解率隨含SIS海綿比例的增加，降解速度加快。1wt%組每周約降解14%，2wt%平均降解15%， 3 wt%平均為18%，1∶4平均為30%，表2。

2.6BMSCs的聯(lián)合培養(yǎng)

表2 不同質(zhì)量濃度的SIS海綿的殘余重量均數(shù)

2.6.1細(xì)胞形態(tài) 剛接種時(shí)，骨髓細(xì)胞懸液中的細(xì)胞呈圓形，大小不一，不能辨認(rèn)細(xì)胞核；2 d后，細(xì)胞開始貼壁，形態(tài)不一，以多角形為主，其次還有梭形，三角形細(xì)胞，換液后懸浮的血細(xì)胞逐漸被清除，大約2次換液后基本完成純化過程。大約7 d后形成細(xì)胞集落，無接觸抑制，大部分呈不規(guī)則形，層次不清，2 w后細(xì)胞長滿全層。見圖4A。

2.6.2細(xì)胞鑒定 取1 w的細(xì)胞傳代，將多聚賴氨酸包被的載玻片放入培養(yǎng)瓶中，待鋪滿后，取出，鈣鈷法堿性磷酸酶染色呈弱陽性。掃描電鏡觀察，小鼠BMSCs以星形和多角形為主，這和光鏡的觀察結(jié)果一致。見圖4B，圖4C。

2.6.3BMSCs和SIS海綿的聯(lián)合培養(yǎng) 在聯(lián)合培養(yǎng)中，第1天細(xì)胞在不同的海綿中表現(xiàn)都是圓形，未見有明顯的變形和貼服，光鏡下，可見細(xì)胞在支架內(nèi)分布均勻，大小一致，細(xì)胞局部出現(xiàn)集中現(xiàn)象和重疊分布，電鏡可以明顯發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)出了許多凸起和接觸。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞的形態(tài)由圓形變成了星型和長梭型，尤其以孔隙的附近，重疊的現(xiàn)象比較多見。電鏡下，細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)鋪路石樣的改變，將支架表面大部分覆蓋，而且在周圍出現(xiàn)了大量顆粒樣物質(zhì)，尤其在細(xì)胞集中的位置多見，在不同SIS濃度的支架材料中，隨著濃度的增加，細(xì)胞的變形特點(diǎn)逐漸在培養(yǎng)中變得不明顯，以2wt%組明顯，而且細(xì)胞的集中現(xiàn)象和細(xì)胞周圍的顆?，F(xiàn)象也逐漸消失或變得非常微弱。在由圓形變?yōu)殚L梭形的過稱中，1wt%組的細(xì)胞變形比較快和完整，但隨著濃度的增加，變形的特點(diǎn)和數(shù)量在減弱。在孔隙的位置，細(xì)胞的形態(tài)比較大，而且外形接近長梭型，數(shù)目比較多，而孔隙的周圍細(xì)胞的形態(tài)比較小，類似于圓盤形，數(shù)目較少。見圖4D。

A

B

C

D

A：小鼠BMSCs 2 w時(shí)的相差觀察(×100);B:小鼠BMSCs鈣鈷法堿性磷酸酶染色呈弱陽性(×100);C:小鼠BMSCs掃描電鏡(×1 500);D:小鼠BMSCs在SIS海綿表面生長(×1 500)

圖4BMSCs聯(lián)合培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)

3 討 論

組織工程材料適宜的孔徑以及孔徑分布，對于的細(xì)胞生長和物質(zhì)能量交換十分重要，并且材料的空隙率也會(huì)影響吸收過程 ,此外，將會(huì)利于干細(xì)胞在其上黏附、增殖和分化〔6,7〕。本研究通過胃蛋白酶-EDC冷凍干燥法制備了SIS海綿支架，構(gòu)建出仿生的人工皮膚復(fù)合基質(zhì)，進(jìn)而對其孔隙率、吸水率、干細(xì)胞在其上的黏附性能和分布等進(jìn)行了考察，以確定所制備的支架材料作為組織工程皮膚支架的可行性。

隨著SIS溶液濃度的升高，支架的密度以及孔徑都有所增大，但空隙率卻有所降低。這主要是由于隨著SIS溶液濃度的升高，支架材料孔壁加厚，再加上酰胺基密度升高造成基團(tuán)排斥力增大，從而使支架的密度和孔徑升高，但由于大部分體積被SIS本身占據(jù)，孔隙率卻有所下降。

SIS主要呈線性結(jié)構(gòu)，強(qiáng)度較弱，通常需要對其進(jìn)行交聯(lián)，使其形成三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度〔8〕。本研究嘗試普遍選用的低毒無污染的交聯(lián)劑EDC，考察其對整個(gè)支架材料性能的影響。

理想的組織工程三維支架應(yīng)該模擬體內(nèi)細(xì)胞生存的微環(huán)境，誘導(dǎo)干細(xì)胞與其密切接觸并使其與材料很好的黏附，并最終在其上伸展、增殖以及分化〔9〕。本文制備的SIS海綿，就是以此理念構(gòu)建的具有良好細(xì)胞相容性的人工基質(zhì)材料。在此材料中，膠原蛋白海綿為細(xì)胞提供了一定密度的正電荷，通過靜電作用對細(xì)胞膜上帶有負(fù)電荷的細(xì)胞更有親和力〔10〕。此外，BMSCs包面帶有大量的負(fù)電荷，同時(shí)，膠原蛋白又是細(xì)胞生存所必需的細(xì)胞外基質(zhì)，所以，本研究所構(gòu)建的經(jīng)表面修飾的SIS海綿與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能相類似，可以維持BMSCs黏附、伸展和增殖，可作為組織工程皮膚較理想的支架。

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