趙振華 劉昌云 李永坤 李云飛 張 旭 雷惠新

(福建省立醫(yī)院 福建醫(yī)科大學省立臨床學院神經內科，福建 福州 350001)

多發(fā)性硬化(MS)最常累及的部位為腦室周圍白質、視神經、脊髓、腦干和小腦〔1〕。MS的病因及發(fā)病機制尚不明確，可能與病毒感染、自身免疫反應，遺傳因素、環(huán)境因素等有關，其中自身免疫反應占重要地位〔2,3〕。MOG誘導建立的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型的臨床表現(xiàn)及中樞神經系統(tǒng)炎癥浸潤和脫髓鞘的組織病理表現(xiàn)與MS相似，已成為國際上研究MS的主要模型〔4〕。細胞外信號調節(jié)激酶1/2(ERK1/2)在自身免疫性疾病中的作用還不清楚，且存在爭議。本研究旨在研究該途徑在EAE的發(fā)病的不同時期，在不同的組織中表達情況，進一步探討該途徑在EAE發(fā)生過程中的作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物及試劑 雌性C57BL/6小鼠10只，8～10周齡，體重(18±2)g ，清潔級，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。鼠源的MOG35-55 多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)由上海生物工程有限公司合成，純度為DHPLC>97%，完全弗氏佐劑(CFA)和滅活的結合桿菌(H37Ra)均購自Difco公司，百日咳毒素購自Sigma公司。

1.2模型誘導 將抗原MOG35-55多肽稀釋成300 μg/50 μl，按1∶1加入等量完全弗氏佐劑,并將結核桿菌含量補充至5 mg/ml混合,充分乳化后按每只100 μl于小鼠腋窩皮下注射。免疫當天及24 h后經小鼠尾靜脈注射100 μl含200 ng百日咳毒素的PBS。PBS對照組則用PBS代替抗原，余同EAE組小鼠的誘導。

1.3神經功能評分 自免疫誘導當日起開始測量小鼠的體重，并采用雙盲法進行神經功能評分，具體評分標準如下〔5〕：0級，無臨床表現(xiàn)；1級，精神委靡，尾部無力；2級，行走步態(tài)異常，雙后肢無力；3級，雙后肢癱瘓；4級，雙后肢癱瘓伴一側或者兩側前肢癱瘓；5級，瀕死或者死亡。

1.4組織取材與病理學分析 在EAE模型發(fā)病的初期以及高峰期，將小鼠經水合氯醛腹腔注射麻醉后，取其頸膨大及腰膨大處的脊髓，置于4%的多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片，HE和固蘭染色觀察〔6〕。

1.5Western印跡 小鼠經水合氯醛腹腔注射麻醉后，取出脊髓及淋巴結，冰浴下勻漿，加入蛋白酶抑制劑和細胞裂解液充分吹打混勻后，4℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清，分裝。以小牛血清作為標準品蛋白，采用Bradford 方法在分光光度計上進行蛋白定量。SDS PAGE采用4%積層膠，10%分離膠，上樣量為80 μg，以12 V/cm電壓分離蛋白后取出凝膠電轉移至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入單克隆抗體(P-ERK1/2、ERK1/2、P-MEK1/2、MEK1/2)4℃孵育過夜，TBST漂洗5 min×3次后，加入帶有辣根過氧化物酶的相應Ⅱ抗室溫孵育1 h，增強化學發(fā)光法顯示蛋白質條帶。將膠片結果掃描，用Bio Rad公司Quantity-One 軟件進行條帶灰度值分析。采用GAPDH作為內參對照。

1.6統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0 軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1臨床表現(xiàn) 如圖1所示，對照組小鼠無發(fā)病，EAE組小鼠均有發(fā)病。EAE組小鼠在免疫后(13.6±2.1)d起病，臨床表現(xiàn)為精神萎靡、尾部張力減弱或消失。隨著病情發(fā)展且癥狀逐漸加重，出現(xiàn)雙后肢無力拖地、共濟失調等。在免疫后(17.0±2.8)d，EAE組小鼠病情發(fā)展到高峰，上肢也出現(xiàn)無力，嚴重者出現(xiàn)四肢癱甚至死亡，高峰期臨床評分為(2.8±1.1)分。

2.2病理表現(xiàn) HE染色顯示EAE 組小鼠脊髓實質中均有炎性細胞浸潤，但病變分布以脊髓頸腰膨大為主,表現(xiàn)為大量淋巴細胞和中性粒細胞浸潤,浸潤沿包膜和小血管由外向內延伸，小血管周圍可見血管套形成。固蘭染色可見在炎癥浸潤區(qū)域，脊髓白質中有大小不等的片狀髓鞘脫失區(qū)，髓鞘纖維疏松，大量空泡形成。對照組小鼠脊髓均未見明顯異常改變(圖2)。

2.3ERK1/2蛋白的磷酸化參與EAE的發(fā)生 無論是發(fā)病前還是在發(fā)病高峰期，EAE組小鼠淋巴結中的ERK1和ERK2的磷酸化均被明顯抑制。如圖3A所示，發(fā)病前期的EAE組小鼠淋巴結未見明顯磷酸化的ERK1/2表達。如圖3B所示，發(fā)病高峰期的EAE組有少量磷酸化的ERK1/2表達，與對照組相比，兩者間的差別有統(tǒng)計學意義(0.10±0.07 vs 0.83±0.22，P=0.012)。EAE組小鼠脊髓中的MEK1/2的磷酸化與對照組相比均無明顯差異。如圖4A所示，發(fā)病前期EAE組小鼠淋巴結的磷酸化MEK1/2的表達與PBS對照組相比差別無統(tǒng)計學意義(0.52±0.21 vs 0.47±0.08,P=0.710)。如圖4B所示，發(fā)病高峰期EAE組小鼠淋巴結的磷酸化MEK1/2的表達與PBS對照組相比差別也無統(tǒng)計學意義(0.62±0.06 vs 0.59±0.19,P=0.789)。

對各組小鼠脊髓的中的ERK1/2的磷酸化情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)無論是發(fā)病前還是在發(fā)病高峰期，EAE組小鼠脊髓中的ERK1和ERK2的磷酸化與PBS對照組相比均無明顯差異。如圖5A所示，發(fā)病前期EAE組小鼠脊髓的磷酸化ERK1/2的表達與PBS對照組相比差別無統(tǒng)計學意義(0.88±0.99 vs 0.47±0.25,P=0.527)。如圖5B所示，發(fā)病高峰期EAE組小鼠脊髓的磷酸化ERK1/2的表達與PBS對照組相比差別也無統(tǒng)計學意義(2.51±1.8 vs 10.18±8.18,P=0.244)。

圖1 EAE組和對照組小鼠的臨床評分

圖2 EAE組和對照組小鼠脊髓切片HE和固蘭染色結果

圖3 EAE組和對照組小鼠淋巴結ERK1/2表達

圖4 EAE組小鼠和對照組小鼠淋巴結的MEK1/2表達情況

圖5 EAE組和對照組小鼠脊髓ERK1/2的表達

3 討 論

MS的發(fā)病機制復雜多樣，但免疫機制仍然占主要地位，而EAE作為其免疫機制的小鼠模型，則主要是由于CD4+T細胞介導，ERK1/2是將信號從細胞表面受體傳導至細胞核的關鍵，被認為是經典的MAPK信號通路。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2信號通路的激活能促進T淋巴細胞的活化、增殖并抑制其凋亡，這可能為T淋巴細胞相關的免疫性疾病的治療提供了新的策略。

盡管近幾年，關于ERK1/2途徑研究已越來越多，但是ERK1/2在自身免疫性疾病中的作用還不清楚，且存在爭議。Nekrasova等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，用MOG35-55誘導ERK1基因缺陷小鼠建立的EAE小鼠模型中，T細胞的增殖和細胞因子的產生并沒有受到影響，而且所誘導的EAE小鼠脾臟的T淋巴細胞同樣具有致病性，但是ERK1基因缺陷小鼠具有EAE易感性，ERK1與EAE的發(fā)生有關。他們認為ERK1與T細胞的成熟、活化、分化無關，ERK2可能可以在ERK1缺乏時發(fā)揮作用，具體還不清楚。由于ERK2基因敲除小鼠在胚胎期就會死亡，因此關于ERK2功能的研究還有待進一步研究。同樣是用MOG35-55誘導ERK1基因缺陷小鼠建立的EAE小鼠模型，Agrawal等〔8〕研究卻顯示ERK1基因的缺失會導致Th1細胞極化， IFN-γ的生成增多，影響了Th1細胞和Th2細胞的平衡，從而導致EAE的易感性提高。除了用環(huán)境不同對EAE的影響不同來解釋這個差別，目前還沒有更好的解釋。除了基因小鼠外，多數(shù)ERK1和ERK2的功能的研究是建立在MEK1/2的抑制劑上，不區(qū)分ERK1和ERK2兩個單體，其結果與基因敲除存在差異。Brereton等〔9〕用MEK1/2 的抑制劑U0126來抑制EAE小鼠體內的ERK的活化，結果發(fā)現(xiàn)EAE的嚴重程度降低。在本研究中，無論是在發(fā)病前還是發(fā)病的高峰期，在EAE小鼠的淋巴結中ERK1和ERK2的表達與正常小鼠相比沒有變化，且ERK1/2的上游激酶的磷酸化水平也沒有發(fā)生變化，但是ERK1和ERK2的磷酸化均受到抑制，由此我們認為，ERK1和ERK2在EAE的發(fā)病過程中都起到了一定的作用，這種作用可能是二者共同作用的結果，二者可能共同參與EAE的始動。由此可見，ERK1和ERK2在EAE的發(fā)病過程中并未起到決定作用。不管是在發(fā)病前期和發(fā)病高峰期，EAE小鼠的淋巴結中ERK1和ERK2的磷酸化水平都受到明顯的抑制，可見ERK1和ERK2在淋巴結中的磷酸化情況與疾病的發(fā)病程度沒有明顯的關系，抑制淋巴細胞中ERK1和ERK2的磷酸化并不能增加EAE的發(fā)生。盡管如此，在脊髓中，無論是否發(fā)病，無論發(fā)病嚴重程度，ERK1和ERK2及其磷酸化水平均未見明顯變化。由此，我們發(fā)現(xiàn)本研究的結果與上述研究者的結論存在差別，我們認為ERK1/2途徑在實驗性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病過程中的組織特異性作用，而造成這種差別的主要原因可能是，不管是基因敲除還是抑制劑，都是從整體去研究，影響到全身各個器官和組織，而ERK1和ERK2蛋白功能可能具有組織特異性，且可能不是孤立的發(fā)揮作用，而是受到其他因素的影響，還有待于進一步研究探討。

4 參考文獻

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7Nekrasova T, Shive C, Gao Y,etal. ERK1-deficient mice show normal T cell effector function and are highly susceptible to experimental autoimmune encephalomyelitis〔J〕, J Immunol, 2005;175(4):2374-80.

8Agrawal A, Dillon S, Denning TL,etal. ERK1-/-mice exhibit Th1 cell polarization and increased susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis〔J〕. Immunol, 2006; 176(10): 5788-96.

9Brereton CF, Sutton CE, Lalor SJ,etal. Inhibition of ERK MAPK suppresses IL-23-and IL-1-driven IL-17 production and attenuates autoimmune disease〔J〕. J Immunol, 2009; 183(3):1715-23.