唐任光 韋道文 呂建生 趙 楓 黃海舸 曾冬云 黃許森 梁 亮

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000)

結(jié)直腸癌的病因和癌變機(jī)制仍不清楚，遺傳因素在其中起著重要的作用。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)中的一個(gè)重要部分，它可誘導(dǎo)局部血管增生、胞外基質(zhì)生成以及抑制免疫監(jiān)視等作用，因而它在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用〔1〕。分子生物學(xué)研究表明TGF-β1基因存在著基因變異及基因多態(tài)性，這種基因多態(tài)性與乳腺癌、前列腺癌、肝癌等〔2～4〕多種疾病存在密切相關(guān)性。關(guān)于TGF-β1基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌之間是否存在相關(guān)性，是否通過影響血清可溶性TGF-β1水平的表達(dá)而影響結(jié)直腸癌的病程等等，國內(nèi)、外未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法，研究TGF-β1基因多態(tài)性及血清TGF-β1水平與廣西地區(qū)結(jié)直腸癌的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取經(jīng)臨床病理檢查確診的結(jié)腸癌患者118例，男79例，女39例，年齡39～76歲，平均(57.6±7.7)歲。正常對照組130例，男85例，女45例，年齡32～75歲，平均年齡(55.8 ±7.2)歲，為正常體檢標(biāo)本。所有血液標(biāo)本均取右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的廣西籍人群。

1.2研究方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物〔5〕，由北京賽百盛有限公司合成。用于特異性擴(kuò)增TGF-β1基因包含-509位點(diǎn)的一段DNA引物序列為正義鏈：5′-CAGACTCTAGAGACTGTCAG-3′；反義鏈：5′-GTCACCAGA GAAAGAGGAC-3′。

1.2.2基因組DNA提取 采用已建立的改良Na I法〔6〕。

1.2.3聚合酶鏈反應(yīng)基因擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系均為25 μl，其中含10×PCR Buffer 2.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 U，引物正義鏈、反義鏈各20 pmol，模板DNA為200 ng，TaqDNA聚合酶1.25 U，不足體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μl。置熱循環(huán)儀(TC-48/H)中94℃預(yù)變性5 min；再按下列程序循環(huán)35次，即94℃變性40 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min；末次循環(huán)后，72℃延伸5 min。

1.2.4基因型鑒定 酶切體系包括TGF-β1基因-509C/T位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，用限制性內(nèi)切酶(英國Biolabs公司提供)Bsu36Ⅰ6 U于37℃水浴酶切3 h。TGF-β1基因-509C/T位點(diǎn)酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳-溴乙啶染色法檢測，DNA標(biāo)準(zhǔn)物為DL-2000 Marker。電泳、染色后在紫外燈下鑒定結(jié)果，并拍照。

1.2.5血清TGF-β1水平的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測定TGF-β1血清水平，試劑盒由比利時(shí)Bio Source 公司產(chǎn)品，具體操作步驟如下：分別加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣本各100 μl，辣根過氧化物酶結(jié)合的TGF-β150 μl ，室溫孵育2 h，棄上清液，再加入顯色劑(TMB) 100 μl，室溫、避光孵育30 min終止反應(yīng)。VIDAS型酶標(biāo)儀(德國產(chǎn))450 nm 處讀取A值。

2 結(jié) 果

2.1TGF-β1基因型檢測結(jié)果 TGF-β1基因-509C/T多態(tài)性檢測共觀察到CC(190 bp和229 bp)、CT(190 bp、229 bp和419 bp)和TT(419 bp)3種基因型。見圖1。

1～3：TT基因型；4：CT基因型；5～7：CC基因型； M：DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)

2.2結(jié)直腸癌和正常對照組TGF-β1基因型和等位基因頻率分布 兩組TGF-β1-509C/T基因CC、CT和TT基因型分布差異顯著(χ2=7.182，P<0.05)，等位基因頻率在兩組存在顯著差異(χ2=6.877，P<0.05)，等位基因頻率的相對風(fēng)險(xiǎn)分析發(fā)現(xiàn)，攜帶T等位基因的個(gè)體患食管癌的相對風(fēng)險(xiǎn)度增加1.759倍(OR=1.759，95%CI：1.150～2.691)。見表1。

表1 兩組研究對象TGF-β1基因多態(tài)性分布〔n(%)〕

2.3結(jié)直腸癌組和正常對照組TGF-β1血清水平的比較 結(jié)直腸癌組與正常對照組TGF-β1血清水平差異顯著〔(49.37±8.32)μg/L vs (21.38±6.25)μg/L，P<0.01〕。

2.4結(jié)直腸癌組各基因型間TGF-β1血清水平比較 TGF-β1基因-509C/T多態(tài)性CC基因型血清TGF-β1水平與TT+CT基因型之間比較差異顯著(45.08±8.86)μg/L vs (51.85±8.73)μg/L，P<0.01。

3 討 論

TGF-β1是具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，主要通過自分泌及旁分泌發(fā)揮生物學(xué)作用，它能夠抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，促進(jìn)血管生成因子，細(xì)胞黏附因子生成，改變細(xì)胞生存環(huán)境，有利于增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲力及轉(zhuǎn)移細(xì)胞成活，與腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切〔7〕。TGF-β1基因位于第19號(hào)染色體長臂上，含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，分子生物學(xué)研究表明TGF-β1基因第1外顯子存在著基因變異及基因多態(tài)性，這種基因多態(tài)性可影響TGF-β1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而影響TGF-β1相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。

本研究提示T等位基因可能是結(jié)直腸癌的遺傳易感基因，且血清中TGF-β1水平的升高與結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。出現(xiàn)這一結(jié)果的可能原因是，結(jié)直腸癌患者自分泌TGF-β1因子增強(qiáng)，高表達(dá)的TGF-β1使腫瘤細(xì)胞迅速地自主性生長而不受機(jī)體的控制，導(dǎo)致體內(nèi)TGF-β1水平的升高。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)在病理?xiàng)l件下，攜帶T等位基因的個(gè)體可促進(jìn)TGF-β1的高度表達(dá)而增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，TGF-β1基因-509C/T多態(tài)性與結(jié)直腸癌具有相關(guān)性，其中T等位基因是結(jié)直腸癌的遺傳易感基因，攜帶T等位基因的個(gè)體可促進(jìn)TGF-β1的高度表達(dá)進(jìn)而增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

4 參考文獻(xiàn)

1Wong SF，Lai LC.The role of TGF beta in human cancers〔J〕.Pathology，2001；33(1)：85-92.

2Dunning AM，Ellis PD，McBride S,etal.A transforming growth factor beta1 signal peptide variant increases secretion in vitro and is associated with increased incidence of invasive breast cancer〔J〕.Cancer Res，2003；63(10):2610-5.

3Li Z，Habuchi T，Tsuchiya N,etal.Increased risk of prostate cancer and benign prostatic hyperplasia associated with transforming growth factor-beta 1 gene polymorphism at codon10〔J〕.Carcinogenesis，2004；25(2):237-40.

4Kim YJ，Lee HS，Im JP,etal.Association of transforming growth factor-beta1 gene polymorphisms with a hepatocellular carcinoma risk in patients with chronic hepatitis B virus infection〔J〕.Exp Mol Med，2003；35(3):196-202.

5Stanczuk GA，Tswana SA，Bergstrom S,etal.Polymorphism in codons 10 and 25 of the transforming growth factor-beta 1(TGF-beta1) gene in patients with invasive squamous cell carcinoma of the uterine cervix〔J〕. Eur J Immunogenet，2002；29(4)：417-21.

6唐任光，韋葉生，黃照河.轉(zhuǎn)化生長因子+869T/C多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)系〔J〕.臨床檢驗(yàn)雜志，2009；27(4)：270-1.

7Fukuchi M，Masuda N，Miyazaki T,etal.Decreased Smad4 expression in the transforming growth factor-beta signaling pathway during progression of esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Cancer，2002；95(4):737-43.