張 茹 徐正磊 譚慶紅

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院消化內(nèi)科,廣東 深圳 518000)

結(jié)直腸癌(CRC)治療以手術(shù)為主，輔以放化療、中醫(yī)藥等綜合治療，費(fèi)用高，治療后復(fù)發(fā)常見，患者生存時(shí)間和生存質(zhì)量欠佳。該病致病機(jī)制研究認(rèn)為，癌基因、抑癌基因及DNA修復(fù)基因的改變，尤其是癌基因的突變、缺失是CRC發(fā)病的重要原因〔1，2〕。細(xì)胞黏附分子1/肺癌抑制因子-1(CADM1/TSLC1)在對肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CADM1廣泛表達(dá)在人體正常組織中，而該基因在癌組織中的啟動(dòng)子高甲基化，導(dǎo)致其表達(dá)減少。其他研究表明CADM1在上皮來源腫瘤發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮不容忽視的作用〔3〕。肺癌差異表達(dá)基因(DAL-1)是具有維持細(xì)胞膜穩(wěn)定作用的一類細(xì)胞膜骨架蛋白，且與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞間相互作用密切相關(guān)〔2〕，研究推測DAL-1不僅能維持正常腸道組織結(jié)構(gòu)和正常腸道上皮細(xì)胞的增殖及黏附作用且具有阻止腸上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的功能〔4〕。CADM1和DAL-1基因共同參與穩(wěn)定細(xì)胞骨架及維持細(xì)胞黏附性，在CRC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的抑癌作用，當(dāng)失活或缺失時(shí)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移或侵襲。本研究探討兩種基因在CRC中的可能表達(dá)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1資料 選取2010年11月至2013年3月在我院行結(jié)腸鏡切除或開腹手術(shù)切除治療的患者，35例標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診，未接受化療；低分化5例、中分化16例、高分化14例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移18例。結(jié)直腸腺瘤標(biāo)本15例。距CRC癌中心10 cm處的正常組織35例，其中男21例，女14例，年齡31～72〔平均(57.1±12.2)〕歲。根據(jù)Dukes分期，癌組織經(jīng)病理檢查后，A+B期14例，C+D期21例。

1.2方法

1.2.1材料 選取美國Santa Cruz Biotechnology 公司生產(chǎn)的兔抗人多克隆抗體CADM1和Abcam公司生產(chǎn)的DAL-1/4.1B兔抗人多克隆抗體，免疫組化所用的鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉公司。

1.2.2檢測方法 所有標(biāo)本中均置入組織保存液，用10%中性緩沖甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片厚度為5 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色進(jìn)行病理診斷和分型。采用SABC法和Western 印跡法檢測CADM1和DAL-1/4.1B的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡檢測的標(biāo)本組織去除周圍脂肪組織，沖洗殘留血液，放入冰盒中，存放于-80℃低溫冰箱備用。

1.2.3免疫組織化學(xué)SABC法 組織標(biāo)本經(jīng)處理后，采用二甲苯進(jìn)行脫蠟處理，對組織進(jìn)行水化、修復(fù)抗原、滴加一抗CADM1及DAL-1/4.1B(1∶100)與靶蛋白結(jié)合、生物素化二抗(1∶200)及SABC試劑與一抗結(jié)合、DNA顯色、HE復(fù)染、脫水、透明和封片處理。用已知的正常結(jié)直腸組織切片(CADM1及DAL-1/4.1B陽性)作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液代替一抗作陰性對照，進(jìn)行鏡下觀察。

1.2.4Western 印跡 將凍存于-80℃冰箱中的組織標(biāo)本取出，按照提取細(xì)胞和組織標(biāo)本總蛋白、二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度、配置10%蛋白分離膠和5%積層膠、變性蛋白和上樣、蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗與靶蛋白結(jié)合、過氧化物酶標(biāo)記二抗與相應(yīng)一抗結(jié)合、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測和半定量分析進(jìn)行操作。將X線片放置于UVI凝膠成像系統(tǒng)攝影，用圖像分析軟件Quantity one分析條帶灰度值，用目的條帶/β-actin代表分子相對表達(dá)量。

1.3染色結(jié)果評價(jià)〔5〕采用Olympus顯微鏡和顯微攝像儀觀察染色組織并照相記錄，圖像分析采用HMIAS-2000型全自動(dòng)彩色圖像分析系統(tǒng)。CADM1與DAL-1/4.1B蛋白均以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比乘積計(jì)量陽性情況：乘積≥2分為免疫組織化學(xué)陽性，<2分為陰性。染色強(qiáng)度：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞百分比：高倍鏡下(×400)按照隨機(jī)選取每張切片5個(gè)視野觀察細(xì)胞，每個(gè)視野500個(gè)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)算陽性細(xì)胞所占百分比：陰性為0分，陽性細(xì)胞<10%為1分，陽性細(xì)胞10%～50%為2分，陽性細(xì)胞>50%為3分。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS14.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1CADM1與DAL-1/4.1B蛋白的表達(dá) CADM1和DAL-1/4.1B蛋白的陽性以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性細(xì)胞散在分布，多數(shù)位于結(jié)直腸癌腺體和細(xì)胞膜上，組織間質(zhì)較少。CADM1和DAL-1/4.1B蛋白在CRC組織的表達(dá)顯著低于正常結(jié)直腸組織(P<0.05)。但CADM1和DAL-1/4.1B蛋白在腺瘤組織中的表達(dá)雖然低于正常對照組，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 CADM1和DAL-1/4.1B蛋白在三組中的表達(dá)〔n(%)〕

2.2CADM1與DAL-1/4.1B蛋白與β-actin 灰度值比值比較 采用圖像分析軟件Quantity one分析條帶灰度值，用目的條帶/β-actin代表分子相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，CRC組織中CADM1和DAL-1/4.1B蛋白的灰度值與β-actin灰度值的比較顯著小于腺瘤組和正常對照組(P<0.05)。見表2。

表2 CADM1和DAL-1/4.1B蛋白與β-actin灰度值比值比較±s)

2.3CADM1和DAL-1/4.1B相關(guān)性 二者與β-actin灰度值比值呈正相關(guān)(r=0.707，P<0.05)。且根據(jù)Dukes分期，發(fā)現(xiàn)在Dukes分期C+D中兩者表達(dá)的陽性率顯著低于A+B分期(P<0.05)。

2.4CRC臨床病理學(xué)特征與CADM1與DAL-1/4.1B蛋白表達(dá)關(guān)系 CADM1和DAL-1/4.1B蛋白僅與Dukes分期C+D中的表達(dá)陽性率相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 CRC臨床病理學(xué)特征與CDM1、DAL-1/4.1B蛋白表達(dá)的關(guān)系(n)

3 討 論

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)動(dòng)態(tài)、復(fù)雜、多步驟的過程，腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附是腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一〔6〕。細(xì)胞黏附是由細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)連接的一類跨膜糖蛋白介導(dǎo)的，在腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移過程中起著非常重要的作用〔7〕。而與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的CADMA1級聯(lián)抑癌基因通路發(fā)揮著重要作用。CADM1級聯(lián)抑癌基因通路包括：CADM1、DAL-1及MPP3三個(gè)基因。目前已發(fā)現(xiàn)CADM1級聯(lián)抑癌基因在部分人CRC細(xì)胞系和病理組織標(biāo)本中表達(dá)明顯減少甚至消失，并且基因啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài)是調(diào)控該通路基因表達(dá)的一個(gè)主要機(jī)制。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，該抑癌基因通路表達(dá)變化還具有隨著CRC患者病情進(jìn)展而愈加明顯的趨勢。DAL-1/4.1B/ EPB41L3基因是蛋白4.1超家族中的一員，位于染色體18p11.3，是一種抑癌基因，該基因首先在小鼠大腦神經(jīng)髓鞘的副結(jié)區(qū)被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其存在于多種組織器官中〔8〕。并認(rèn)為DAL-1在構(gòu)成細(xì)胞膜和聯(lián)通細(xì)胞質(zhì)內(nèi)通路蛋白信號(hào)發(fā)揮重要作用〔9〕。在CRC研究方面，國內(nèi)外對于CADM1級聯(lián)通路的研究較少，本研究希望研究CADM1和DAL-1/4.1B在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制，了解其在結(jié)直腸癌中所發(fā)揮的作用，為結(jié)直腸癌未來的診斷治療工作提高有效的理論依據(jù)〔10〕。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CADM1與DAL-1/4.1B蛋白與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系。分析原因可能為CADM1、DAL-1及MPP3基因共同構(gòu)成了在上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮級聯(lián)抑癌作用的通路，CADM1的 PDZ和FERM結(jié)合基序與DAL-1和MPP3相互連接形成的三聚體在維持正常組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間黏附、細(xì)胞極性及形態(tài)發(fā)揮舉足輕重的作用，該通路失活可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展，且啟動(dòng)子高甲基化可能是調(diào)控該通路的一個(gè)重要分子機(jī)制。通過實(shí)驗(yàn)及研究，可以認(rèn)為CADM1與DAL-1/4.1B蛋白是組織肌動(dòng)蛋白骨架的重要構(gòu)成因素，且CADM1的失活會(huì)直接引起級聯(lián)通路中DAL-1和MPP3在組織中表達(dá)的減少，對膜穩(wěn)定產(chǎn)生影響。且實(shí)驗(yàn)中的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在結(jié)直腸組織中，CADM1和DAL-1/4.1B的表達(dá)部位相近，二者灰度值及染色強(qiáng)度等均呈明顯相關(guān)性。因此，CADM1和DAL-1/4.1B的表達(dá)程度與CRC的發(fā)生進(jìn)展具有密切的聯(lián)系。但是，也有研究顯示，基于4.1B敲除小鼠的研究顯示4.1B蛋白可能抑制癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，可是小鼠本身未見任何表型變化〔9〕。因此推斷，CADM1在CRC的發(fā)生中可能起著更為重要的作用，尚需進(jìn)一步研究。

綜上，CRC的發(fā)生與CADM1和DAL-1/4.1B基因表達(dá)的異常有關(guān)，是一個(gè)漸進(jìn)及多步驟的基因改變過程，且大量研究表明，抑癌基因的突變、缺失和沉默失活在CRC發(fā)病中發(fā)揮重要的作用，如腺瘤樣結(jié)腸息肉病易感基因、CRC突變基因及CRC缺失基因等。因此，如何能夠更為徹底地了解基因表達(dá)與CRC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系并以各基因靶點(diǎn)作為出發(fā)點(diǎn)采用分子技術(shù)靶向治療CRC值得進(jìn)一步的探討研究。

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