楊 洋 樊玉霞 劉東雷 吳 愷 溫豐標(biāo) 趙 松

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總發(fā)病率的80%，起病隱襲，早期癥狀不典型，確診時(shí)常已處于進(jìn)展期，失去了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，5年生存率僅為15%〔1〕。肺癌預(yù)后較差不僅與早期診斷率低有關(guān)，更主要的是其較高的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移需要細(xì)胞表面黏附相關(guān)分子的改變，此過程與腫瘤細(xì)胞的鈣離子蛋白A4(S100A4)有著密不可分的關(guān)系〔2〕。本文通過觀察S100A4對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響，探討S100A4與肺癌發(fā)生的關(guān)系和對(duì)治療的指導(dǎo)意義。

1 資料和方法

1.1材料 收集2012年10月至2013年12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科行外科手術(shù)切除的NSCLC標(biāo)本及配對(duì)正常肺組織各67例。兔抗人S100A4多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology，S-P免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué) 采用免疫組織化學(xué)S-P法，按照試劑盒說明操作。切片脫蠟、水化，經(jīng)PBS漂洗后在3%過氧化氫溶液中孵育5～10 min。用抗原修復(fù)液修復(fù)抗原后加入山羊非免疫血清工作液封閉，滴加一抗工作液后4℃過夜，PBS漂洗后加入二抗工作液以及鏈酶卵白素工作液，二氨基聯(lián)苯胺顯色后蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。

1.2.2結(jié)果判斷 由2位病理科醫(yī)師在不知道患者臨床資料的情況下，獨(dú)立觀察每張切片，每例切片在400倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野。首先根據(jù)染色強(qiáng)度(A)進(jìn)行半定量計(jì)分：不染色為0分，輕度染色(淡黃色)為1分，重度染色(棕黃色)為2分，強(qiáng)染色(褐色)為3分；然后按照陽性細(xì)胞比例(B)評(píng)分：陽性細(xì)胞<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果A×B，將結(jié)果分為0分，陰性(-)；1～4分，弱陽性(+)；5～8分，中度陽性()；9～12分，強(qiáng)陽性()。

1.2.3CCK-8法檢測細(xì)胞活力 選對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96孔板，將不同濃度的重組人S100A4蛋白2、4、6、8、10 μg/ml分別與A549細(xì)胞在恒溫孵箱中共同培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后向每孔加入10 μl CCK-8溶液繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度A值，計(jì)算生長抑制率(IR)=1-(A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

1.2.4細(xì)胞周期分析 取4 μg/ml 和6 μg/ml 重組人S100A4蛋白處理48 h后的A549細(xì)胞，0.2%胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄去上清；用PBS洗兩遍，離心后棄去，加入70%冰乙醇固定30 min，4℃過夜；上機(jī)前，1 000 r/min離心5 min，棄去乙醇，PBS漂洗三遍；加入1 ml PBS制成細(xì)胞懸液，加RnaseA(終濃度50 μg/ml)，室溫放置1 h；調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106，加1 ml碘化吡啶(100 μg/ml)，避光30 min，最后通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

2 結(jié) 果

2.1S100A4在NSCLC組織中的表達(dá)與臨床資料、病理參數(shù)的關(guān)系 S100A4蛋白的陽性反應(yīng)物質(zhì)呈棕黃色或棕褐色，主要定位于胞質(zhì)內(nèi)，少量位于胞核或胞膜上。S100A4在癌組織中呈顯著高表達(dá)(49/67，73.1%)，顯著高于正常肺組織(9/67，13.4%)，且其在肺腺癌中的陽性表達(dá)率明顯高于肺鱗癌和大細(xì)胞肺癌；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC標(biāo)本中的S100A4陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本，但S100A4陽性表達(dá)率與患者年齡、性別、腫瘤位置及分化程度無明顯相關(guān)(P>0.05)。見圖1，表1。

2.2S100A4蛋白對(duì)肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 S100A4蛋白具有促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞增殖的作用，且呈濃度依賴性(圖2)。同時(shí)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與未加任何干預(yù)的A549細(xì)胞相比，4 μg/ml 和6 μg/ml 重組人S100A4蛋白處理48 h后的肺癌細(xì)胞，G0/G1期細(xì)胞百分比分別由78.24%下降至69.12%、58.79%，S期細(xì)胞百分比由14.75%上升至18.64%、24.03%，G2/M期由7.03%上升至13.24%、17.18%(P<0.05)。

A：肺腺癌，B：肺鱗癌，C：大細(xì)胞肺癌，D：正常肺上皮組織

圖2 不同濃度重組人S100A4蛋白對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖能力的影響

表1 S100A4蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

S100A4是鈣結(jié)合蛋白家族的重要成員，具有EF雙螺旋結(jié)構(gòu)，主要通過改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)參與細(xì)胞凋亡、增殖、細(xì)胞黏附、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等多種生命活動(dòng)，在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中可能扮演重要角色〔3〕。近年來有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)S100A4在多種腫瘤細(xì)胞中存在過表達(dá)現(xiàn)象，與惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后差密切相關(guān)〔4～6〕，提示S100A4很有可能是基因治療腫瘤的一個(gè)有效靶點(diǎn)。

通過本文結(jié)果筆者推測S100A4蛋白可能作為致癌因子參與了NSCLC的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。S100A4蛋白處理的肺癌A549細(xì)胞增殖活力明顯增強(qiáng)，且具有濃度依賴性推測S100A4蛋白在NSCLC組織中高表達(dá)，提高了腫瘤細(xì)胞的增殖活力，加速了腫瘤進(jìn)展，但目前其分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。S100A4可能成為抗腫瘤過程中的有效靶點(diǎn)，為腫瘤的基因治療提供了新的方向。

4 參考文獻(xiàn)

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3Ramagopal UA，Dulyaninova NG，Varney KM，etal. Structure of the S100A4/myosin-IIA complex 〔J〕. BMC Struct Biol，2013;13:31.

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6Rasanen K，Sriswasdi S，Valiga A，etal. Comparative secretome analysis of epithelial and mesenchymal subpopulations of head and neck squamous cell carcinoma identifies S100A4 as a potential therapeutic target 〔J〕. Mol Cell Proteomics，2013; 12(12):3778-92.