邢海軍 崔海燕 趙建虎

(張家口市宣化區(qū)醫(yī)院,河北 張家口 075000)

老年結(jié)腸癌在其診斷治療方面有其特有的特點，如癥狀隱匿、早期就診少、手術(shù)耐受性差、化學治療尤為重要等，但在化療過程中產(chǎn)生多藥耐藥是臨床化療成功的主要障礙，因此研究結(jié)腸癌多藥耐藥機制及尋找高效逆轉(zhuǎn)劑具有重要意義〔1〕。芹菜素是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)具有廣泛生物活性，例如抗感染、抗腫瘤及抗氧化等〔2～4〕。但芹菜素對于多藥耐藥細胞的逆轉(zhuǎn)作用研究尚少見，故本課題以結(jié)腸癌耐藥細胞株HCT-8/5-FU為研究對象，觀察芹菜素對多藥耐藥人結(jié)腸癌細胞(HCT-8/5-FU)P-糖蛋白(P-gp)的抑制作用以及對HCT-8/5-FU細胞多藥耐藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。

1 材料與方法

1.1材料 芹菜素，購于Sigma；CCK-8試劑盒、細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；鼠抗人P-gp白單克隆抗體購于中杉金橋；總RNA抽提試劑盒、AMV一步法RT-PCR試劑盒購于上海生工有限公司，MDR-1及內(nèi)參基因引物由上海生工有限公司合成；敏感細胞株HCT-8及其耐藥細胞株HCT-8/5-FU購自凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 敏感細胞株HCT-8培養(yǎng)于無Hepes,含10%小牛血清、100 U/ml慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37 ℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)；相應耐藥細胞株HCT-8/5-FU細胞連續(xù)培養(yǎng)于含15 000 ng/ml的上述培養(yǎng)液中，以維持其耐藥性，實驗前3 d換無藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.2免疫細胞化學法測定耐藥細胞P-gp的表達 實驗設0、10 μmol/L芹菜素組，取對數(shù)生長期細胞，按每孔2×105個接種于放蓋玻片的6孔板中，貼壁后加入不同實驗濃度藥物，培養(yǎng)24 h后取出蓋玻片，多聚甲醛固定10 min，按常規(guī)S-P兩步法染色。根據(jù)細胞染色陽性率分級，無陽性為陰性(-)，陽性率低于25%為弱陽性(+)，陽性率在25%～75%之間為中陽性()，陽性率大于75%為強陽性()。

1.2.3RT-PCR檢測耐藥細胞MDR-1 mRNA的表達 HCT-8/5-FU耐藥細胞經(jīng)0、10 μmol/L 芹菜素組作用24 h后，用總RNA抽提試劑盒抽提總RNA，以β-actin 作為內(nèi)參照，按照AMV一步法RT-PCR試劑盒說明書檢測耐藥細胞內(nèi)MMDR-1 mRNA的表達情況，MDR-1上游引物：5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3'，下游引物：5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'，擴增產(chǎn)物296 bp；β-actin上游引物：5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3'，下游引物：5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'，擴增產(chǎn)物501 bp 。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.2.4CCK-8法測定無細胞毒作用的芹菜素 取處于對數(shù)生長期的HCT-8、HCT-8/5-FU兩株細胞經(jīng)胰酶消化后計數(shù) ,調(diào)整細胞懸液密度為1×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 μl，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 24 h后，加入不同濃度的芹菜素溶液(5,10,20,40，80 μmol/L)，同時設空白對照組(不加細胞僅加培養(yǎng)液)、陰性對照組(不加藥物僅加細胞)。每組均設 4個復孔，置于培養(yǎng)箱中再孵育 24 h后每孔加入20 μl CCK-8溶液,繼續(xù)孵育4 h，以全自動熒光酶儀檢測各孔在490 nm處的光吸收值(A)，由空白孔調(diào)零后，計算芹菜素對兩株細胞的生長抑制率。

1.2.5芹菜素對耐藥細胞耐藥性逆轉(zhuǎn)作用的檢測 實驗分為HCT-8/5-FU+5-FU組，HCT-8+5-FU組，HCT-8/5-FU+5-FU+無細胞毒作用的芹菜素組，5-FU終濃度分別為15， 60,240,960，3 840 μg/ml，實驗步驟同上，分別計算出各組的IC50值，進而計算出耐藥倍數(shù)及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。

1.2.6熒光顯微鏡觀察細胞凋亡 將耐藥細胞株HCT-8/5-FU分為逆轉(zhuǎn)藥物組(無細胞毒作用的芹菜素組)、化療藥物組(無細胞毒作用的5-FU組)、聯(lián)合用藥組、陰性對照組(未加任何藥物)。取潔凈的蓋玻片置于6孔板內(nèi)，種入處于對數(shù)生長期的細胞懸液，分別加入上述分組處理因素，培養(yǎng)24 h后，固定、染色，選擇激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞情況。正常細胞核出現(xiàn)彌漫均勻的低強度熒光，凋亡細胞核呈濃染致密的固縮形態(tài),顏色有些發(fā)白。細胞凋亡指數(shù)計算：每組觀察3張片子，每張片子隨機選擇3個視野，計數(shù)100個細胞中凋亡百分率。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行獨立樣本t檢驗及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1芹菜素抑制P-gp表達 HCT-8/5-FU細胞 P-gp呈強陽性(98.97+2.19)%；經(jīng)10 μmol/L芹菜素作用24 h后,HCT-8/5-FU細胞 P-gp呈中陽性(59.87+3.25)%； 二者差異顯著(P<0.05)。見圖1。

2.2芹菜素下調(diào)MDR-1 mRNA表達 耐藥細胞HCT-8/5-FU高表達MDR-1 mRNA ,經(jīng)10 μmol/L芹菜素處理后，其MDR1 mRNA 表達水平降低。見圖2。

未加芹菜素組 10 μmol/L芹菜素組

1，2：β-actin；3:Marker(100～1 000 bp)； 4:未加芹菜素組；5:10 μmol/L芹菜素組

2.3芹菜素具有細胞毒作用 表1可見，芹菜素對HCT-8/5-FU、HCT-8兩細胞株生長抑制作用相近，其在10 μmol/L以下時對兩組細胞株均無明顯的細胞毒作用，抑制率均在10%以下，芹菜素對兩種細胞的IC50值分別為(79.71±8.65)、(81.70±5.24) μmol/L，二者比較差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 不同濃度芹菜素作用HCT-8/5-FU、HCT-8細胞24 h抑制作用±s,%,n=4)

2.4芹菜素具有逆轉(zhuǎn)耐藥作用 5-FU對HCT-8、HCT-8/5-FU、HCT-8/5-FU+芹菜素的IC50值分別為(830.23±21.79)、(80 242±112.58)、(5 086.1±98.87)μg/ml，耐藥細胞株對5-FU的耐藥倍數(shù)為96.68倍，10 μmol/L芹菜素對耐藥細胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為15.78倍。見表2。

2.5聯(lián)合用藥更能誘導細胞凋亡 HCT-8/5-FU細胞株經(jīng)10 μmol/L芹菜素，509 μg/ml 5-FU作用24 h后均未見明顯凋亡細胞，凋亡指數(shù)分別為(9.88±0.58)%、(8.99±0.69)%，二者比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。經(jīng)10 μmol/L芹菜素+509 μg/ml 5-FU聯(lián)合用藥后可見明顯凋亡，凋亡指數(shù)達(40.21±0.95)%，與前兩者凋亡指數(shù)之和比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

陰性對照組

5-FU組

芹菜素組

芹菜素+5-FU組

表2 5-FU作用24 h對HCT-8、HCT-8/5-FU、HCT-8/5-FU+芹菜素的抑制作用±s,%，n=4)

3 討 論

P-gp是最重要的藥物外排蛋白，由MDR-1基因編碼而成，能與多種被動擴散到細胞內(nèi)的藥物結(jié)合，依靠ATP轉(zhuǎn)化能量將到達細胞內(nèi)的藥物泵出，導致細胞內(nèi)的藥物濃度降低〔1,5〕。HCT-8/5-FU是一種人結(jié)腸癌多藥耐藥細胞株，是通過對敏感細胞株HCT-8用5-FU長期反復誘導而成，高表達P-gp和MDR-1 mRNA〔6〕。本實驗結(jié)果提示，芹菜素在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制了P-gp。此藥物可能對多藥耐藥細胞HCT-8/5-FU多藥耐藥性具有逆轉(zhuǎn)作用 ,進一步，結(jié)果證實，10 μmol/L芹菜素能夠提高5-FU細胞毒作用，可使5-FU對HCT-8/5-FU細胞的IC50值從(80 242±112.58)μg/ml降至(5 086.1±98.87)μg/ml，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)可高達15.78倍，并且在選擇芹菜素逆轉(zhuǎn)耐藥濃度(無細胞毒作用的芹菜素濃度，以排除芹菜素本身對耐藥細胞的殺傷作用)時發(fā)現(xiàn)，芹菜素對耐藥及敏感細胞株的IC50無明顯差別，這說明與敏感細胞株相比，耐藥細胞株對芹菜素沒有產(chǎn)生交叉耐藥，芹菜素對逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌多藥耐藥有著廣泛的應用前景。

近年來還有研究發(fā)現(xiàn)，P-gp除了作為藥物泵可將到達細胞內(nèi)的藥物泵出，導致細胞內(nèi)的藥物濃度降低外，還可通過改變細胞生存的環(huán)境，抑制凋亡相關因子活性，減少質(zhì)膜上的鞘磷脂等機制抑制腫瘤凋亡，從而使腫瘤細胞產(chǎn)生凋亡抗性〔7,8〕。本文結(jié)果提示，當5-FU與芹菜素誘導細胞凋亡情況相似時(凋亡指數(shù)均小于10%)，聯(lián)合用藥后可見明顯凋亡，凋亡指數(shù)增至(40.21±0.95)%，與前兩者凋亡指數(shù)之和比較具有統(tǒng)計學意義，這說明了芹菜素能夠解除了P-gp產(chǎn)生的凋亡抗性，能夠誘導更多的耐藥細胞凋亡。

綜上所述，體外實驗證實,芹菜素可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制P-gp，逆轉(zhuǎn) HCT-8/5-FU細胞的多藥耐藥性,解除了P-gp產(chǎn)生的凋亡抗性，誘導更多的耐藥細胞凋亡。但關于芹菜素逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的體內(nèi)實驗及其藥物代謝動力學、藥物分析化學的研究還有待進一步完成。

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