王建新 馬翠花

(秦皇島市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科， 河北 秦皇島 066000)

宮頸癌已成為女性生命和健康的嚴(yán)重威脅〔1～3〕。盡管高致病性人乳頭瘤病毒(HPV)的感染被認(rèn)為是宮頸癌的主要發(fā)病原因，但越來越多的證據(jù)表明HPV感染并非宮頸癌發(fā)病的單一因素〔4〕。microRNAs(miRNAs)是一類長約21～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，抑制很多靶基因的表達(dá)〔5〕。miRNAs在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡以及腫瘤的發(fā)生過程中起重要作用〔6，7〕。很多miRNAs在不同的癌組織中都有異常表達(dá)，可能與腫瘤的發(fā)生相關(guān)〔8～10〕。研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中miRNAs的異常表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔11～13〕?；蛐酒芯堪l(fā)現(xiàn)miR-886-5p在宮頸癌中的表達(dá)明顯高于癌周及正常組織〔14〕。本實(shí)驗(yàn)通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa細(xì)胞帶有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)簽的miR-886-5p inhibitor/NC，抗生素篩選后選擇表達(dá)GFP的陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達(dá)抑制miR-886-5p的SiHa細(xì)胞系，為深入研究miR-886-5p在宮頸癌SiHa細(xì)胞中的作用提供了良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 宮頸癌SiHa細(xì)胞購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。帶有GFP標(biāo)簽的抑制miR-886-5p表達(dá)質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒(miR-886-5p inhibitors/NC)均來自中國吉瑪公司。主要試劑：DMEM 培養(yǎng)基購自GIBCO 公司，三氯甲烷、異丙醇和無水乙醇均購自北京化學(xué)試劑公司，TRIzol 試劑，MML-V試劑盒和LipofectamineTM2000 均為美國 Invitrogen公司產(chǎn)品，質(zhì)粒小量提取試劑盒購自博大泰克公司，SYBR Premix Ex Taq試劑購自TakaRa公司，PCR 擴(kuò)增引物的合成與 DNA 測(cè)序均由上海生工公司完成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 SiHa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，每3 d換液1次，0.25%胰酶消化傳代，倒置顯微鏡下觀察。在轉(zhuǎn)染前1 d用12孔板接種細(xì)胞，5×105個(gè)/孔，培養(yǎng)過夜，待轉(zhuǎn)染帶有GFP標(biāo)簽的miR-886-5p inhibitor/NC質(zhì)粒，每組3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞長滿60%培養(yǎng)孔底時(shí)，用不含血清的DMEM各500 μl分別稀釋2 μg待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和5 μl LiPofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，室溫放置5 min后，將兩者混合作用20 min形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。分別將1 ml帶有miR-886-5p inhibitor/NC質(zhì)粒的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入各培養(yǎng)孔，輕輕搖勻，37℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)過夜。

1.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，加入5 μg/ml Blasticidin進(jìn)行篩選，每5 d換液1次，直到長出細(xì)胞克隆，在顯微鏡下用胰酶消化，挑出克隆，移至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿繼續(xù)用Blasticidin篩選液培養(yǎng)。3～4 w后，熒光倒置顯微鏡下觀察表達(dá)GFP的陽性克隆，再次用胰酶消化，挑出陽性克隆并用1 μg/ml Blasticidin篩選液大量培養(yǎng)。

1.4RNA提取及莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄 分別收集培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒SiHa細(xì)胞(約5×106個(gè))，按產(chǎn)品說明書，加入1 ml TRIzol試劑，吹勻后室溫放置5 min，加入氯仿 0.2 ml，劇烈搖晃15 s，室溫放置3 min，異丙醇沉淀10 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，加入1 ml 75%乙醇振蕩洗滌后7 500 r/min 4℃離心5 min，吸棄上清，室溫干燥10 min，加入50 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，55℃放置10 min，紫外分光光度計(jì)定量。用1%瓊脂糖凝膠電泳監(jiān)測(cè)RNA質(zhì)量。莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄miR-886-5p的引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACC-CGCTT-3′；以hs-U6作為內(nèi)參，引物序列為5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.5實(shí)時(shí)定量PCR 取總RNA(1～2 μg)，用SYBR Premix Ex Taq Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，蒸餾水補(bǔ)足20 μl體積。以hs-U6作為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)檢測(cè)miRNA的表達(dá)，反應(yīng)包括40個(gè)循環(huán)(95℃，30 s；60℃，1 min)，每次設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。特異性miR-886-5p的上下游引物分別為5′-CGGGTCGGAGTTAGCTCA-3′和5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 snRNA的上下游引物分別為5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′和 5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。其擴(kuò)增曲線和融解曲線說明引物具有很好的特異性，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序分析進(jìn)一步證實(shí)擴(kuò)增特異性。采用ΔΔCt法分析基因的表達(dá)水平〔15〕，即RQ=2-ΔΔCt，〔ΔΔCt=(CtmiRNA-CtU6)樣品(CtmiRNA-CtU6)校正樣品〕。每次實(shí)驗(yàn)包括以水為模板的陰性對(duì)照，根據(jù)(2-ΔΔCT)計(jì)算每對(duì)樣本的相對(duì)表達(dá)量。

(A)SiHa細(xì)胞系穩(wěn)轉(zhuǎn)GFP標(biāo)記的miR-886-5p表達(dá)抑制及對(duì)照質(zhì)粒篩選4 w后熒光鏡圖片；(B) SiHa細(xì)胞系穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-886-5p表達(dá)抑制及對(duì)照質(zhì)粒后miR-886-5p表達(dá)量的qRT-PCR驗(yàn)證，U6snRNA為內(nèi)參，1)P <0.05

2 結(jié) 果

用帶有GFP標(biāo)簽的miR-886-5p inhibitor及對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，Blasticidin篩選3～4 w后于熒光倒置顯微鏡下觀察表達(dá)GFP的陽性克隆(圖1)。挑取陽性克隆大量培養(yǎng)后用qRT-PCR驗(yàn)證穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中miR-886-5p的表達(dá)差異，每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，差異顯著(P<0.05)。見圖1。

3 討 論

眾所周知，高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)病的主要原因，其分子機(jī)制也成為人們研究的焦點(diǎn)。然而HPV感染并不能為宮頸癌的惡變過程提供足夠的證據(jù)，目前其他因素對(duì)宮頸癌的影響也受到了關(guān)注〔14〕。

研究報(bào)道顯示不同miRNAs的異常表達(dá)在不同的癌癥中起著不同的作用〔16～18〕。miRNAs表達(dá)分析顯示miR-143和miR-145在宮頸癌組織及宮頸癌相關(guān)細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，它們起著抑制宮頸癌相關(guān)細(xì)胞的生長作用；而miR-146a在宮頸癌組織及宮頸癌相關(guān)細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，能促進(jìn)宮頸癌相關(guān)細(xì)胞的增殖〔12〕。

目前關(guān)于miRNAs與宮頸癌細(xì)胞的凋亡之間的關(guān)系研究很少，有研究發(fā)現(xiàn)miR-886-5p在宮頸癌的含量明顯高于癌周及癌旁組織。

4 參考文獻(xiàn)

1Bosch FX，de Sanjose S.Chapter 1:Human papillomavirus and cervical cancer-burden and assessment of causality〔J〕.J Natl Cancer Inst Monogr，2003；31(1)：3-13.

2Thomison J 3rd，Thomas LK，Shroyer KR.Human papillomavirus:molecular and cytologic/histologic aspects related to cervical intraepithelial neoplasia and carcinoma〔J〕.Hum Pathol， 2008；39(12)：154-66.

3Chen CY，Liu TZ，Tseng WC，etal.Anonaine induces apoptosis through Bax-and caspase-dependent pathways in human cervical cancer(HeLa) cells〔J〕.Food Chem Toxicol， 2008；46(8)：2694-702.

4Martin CM，Astbury K，O'Leary JJ.Molecular profling of cervical neoplasia〔J〕.Expert Rev Mol Diagn， 2006；6(2)：217-29.

5Liu N，Okamura K，Tyler DM，etal.The evolution and functional diversification of animal microRNA genes〔J〕.Cell Res， 2008；18(10)：985-96.

6Lu J，Getz G，Miska EA，etal.MicroRNAs expression profiles classify human cancers〔J〕.Nature， 2005；435(204)：834-8.

7Esquela-Kerscher A，Slack FJ.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer〔J〕.Nat Rev Cancer， 2006；6(4)：259-69.

8Croce CM.Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer〔J〕.Nat Rev Genet，2009；10(10)：704-14.

9Yanaihara N，Caplen N，Bowman E，etal.Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis〔J〕.Cancer Cell， 2006；9(3)：189-98.

10Calin GA，F(xiàn)erracin M，Cimmino A，etal.A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia〔J〕.N Engl J Med，2005；353(17)：1793-801.

11Yao Q，Xu H，Zhang QQ，etal.MicroRNA-21 promotes cell proliferation and down-regulates the expression of programmed cell death 4(PDCD4) in HeLa cervical carcinoma cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun， 2009；388(3)：539-42.

12Wang X，Tang S，Le SY，etal.Aberrant expression of oncogenic and tumor-suppressive microRNAs in cervical cancer is required for cancer cell growth〔J〕.PLoS ONE 2008；3(7)：e2557.

13Lee JW，Choi CH，Choi JJ，etal.Altered microRNA expression in cervical carcinomas〔J〕.Clin Cancer Res， 2008；14(9)：2535-42.

14Li JH，Xiao Xue，Zhang YN，etal.MicroRNA miR-886-5p inhibits apoptosis by down regulating Bax expression in human cervical carcinoma cells〔J〕.Gynecologic Oncology,2011；120(1)：145-51.

15Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method〔J〕.Methods， 2001；25(4)：402-8.

16Volinia S，Calin GA，Liu CG，etal.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA， 2006；103(7)：2257-61.

17Cummins JM，He Y，Leary RJ，etal.The colorectal microRNAome〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2006；103(10)：3687-92.

18馬 博，鄭建忠.microRNA-146a基因多態(tài)性與胃癌的相關(guān)性分析〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2012；32(15)：3150-2.