張 潔 周慧敏 李鴻燕 郭玉卿 董閃閃 康 巖

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科， 河北 石家莊 050031)

2型糖尿病(T2DM)的發(fā)生主要是胰島素抵抗及分泌胰島素的胰島β細(xì)胞功能缺陷，引起胰島素分泌不足，導(dǎo)致血糖升高。而胰島β細(xì)胞的復(fù)制、再生、增殖、凋亡與胰腺微環(huán)境的變化密切相關(guān)，因此，胰腺微循環(huán)是糖尿病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)。對(duì)老齡T2DM的胰腺微循環(huán)研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察老齡T2DM大鼠胰腺體尾部血液灌注量的變化，探討老齡T2DM微循環(huán)改變的臨床意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與儀器 健康18月齡的清潔級(jí)近交系Wistar老齡大鼠120只，體重250 g左右，雌雄各半，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，由北京拜爾迪生物科技有限公司提供)；胰島素放免分析藥盒(北京北方生物技術(shù)研究所提供)；LISCA激光多普勒微循環(huán)血流圖像儀(LDPI，瑞士產(chǎn))；快速血糖檢測(cè)儀(強(qiáng)生，美國(guó))；全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Beckman公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 健康18月齡的清潔級(jí)近交系Wistar大鼠120只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為對(duì)照組50只，T2DM組70只，均為雌雄各半。

1.2.2老齡DM組大鼠模型制備 對(duì)照組大鼠喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，DM組大鼠喂養(yǎng)高糖高脂飼料。4 w后，禁食12 h，T2DM組大鼠腹腔注射30 mg/kg STZ以pH4.4的0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液配制成1%濃度，對(duì)照組大鼠腹腔注射同等量的檸檬酸鈉緩沖液，72 h后于大鼠尾靜脈采血測(cè)定血糖，以隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L確定為造模成功。從成模的大鼠中選取血糖較高的50只納入正式試驗(yàn)。對(duì)照組大鼠一直喂養(yǎng)普通飼料，造模成功組繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料。每2周測(cè)血糖，以確定大鼠為持續(xù)高血糖狀態(tài)。

1.3指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1大鼠胰腺胰腺體尾部血流檢測(cè)方法 于試驗(yàn)第0、4、8、12、16周末禁食10～12 h，分別從兩組中隨機(jī)取出老鼠10只，應(yīng)用LISCA檢測(cè)胰體尾血液灌注量。1%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開(kāi)激光多普勒微循環(huán)血流圖像儀和組織灌注圖像軟件，待儀器穩(wěn)定后，將麻醉成功的大鼠仰臥固定于鼠臺(tái)上，然后暴露大鼠胰腺體尾部，胰腺周圍用生理鹽水紗布包裹，并且胰腺表面不斷滴上0.9%的生理鹽水，給予保溫保濕，使其盡量接近生理環(huán)境。實(shí)驗(yàn)室溫度控制在24℃～26℃,濕度控制在35%～40%。定位固定激光探頭與胰腺的位置，探頭距胰腺表面10 cm，保證激光垂直照射胰腺，同時(shí)控制實(shí)驗(yàn)室的光線強(qiáng)度。由計(jì)算機(jī)控制激光探頭自動(dòng)掃描胰腺微循環(huán)血流灌注量。處死動(dòng)物留取新鮮胰腺標(biāo)本：大鼠仰臥固定于鼠臺(tái)上，暫將暴露胰腺送回腹腔，暴露下腔靜脈，結(jié)扎下腔靜脈近心端，并置另一條結(jié)扎線于遠(yuǎn)心端備用，2號(hào)或5號(hào)一次性注射器下腔靜脈取血，置于普通管中，然后結(jié)扎遠(yuǎn)心端。血標(biāo)本3 000 r/min離心5 min，取上清液，置于-20℃冰箱保存。

1.3.2血糖測(cè)定 采用快速血糖儀，尾靜脈取血，每個(gè)血樣測(cè)3次，取平均值，專人操作。

1.3.3空腹胰島素測(cè)定 采用放射免疫法，專人操作。

1.3.4甘油三酯(TG)測(cè)定 采用化學(xué)發(fā)光法，專人操作。

2 結(jié) 果

2.1各組個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖變化 成模后對(duì)照組大鼠隨年齡增長(zhǎng)，血糖值穩(wěn)定，均在正常范圍，各時(shí)間段之間無(wú)明顯差別(P>0.05)；T2DM組大鼠血糖顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，T2DM組大鼠隨著病程的進(jìn)展,血糖值逐漸升高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2各組各時(shí)段空腹胰島素水平變化 對(duì)照組大鼠各時(shí)段血胰島素水平無(wú)明顯差別(P>0.05)；T2DM組大鼠血胰島素水平顯著低于同時(shí)相對(duì)照組(P<0.05)，隨T2DM病程延長(zhǎng)，胰島素水平逐漸降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3各組各時(shí)段TG變化 對(duì)照組大鼠各時(shí)段TG無(wú)明顯變化(P>0.05)；T2DM組大鼠TG高于同時(shí)相對(duì)照組(P<0.05)，隨病程延長(zhǎng)，TG逐漸升高(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.4各組各時(shí)段胰體尾血液灌注變化 對(duì)照組大鼠各時(shí)段胰體尾血液灌注量無(wú)明顯變化(P>0.05)；T2DM組大鼠0 w、4 w、8 w、12 w、16 w胰體尾血液灌注量低于同時(shí)相對(duì)照組(P<0.05)；且隨病程延長(zhǎng)，胰體尾血液灌注量呈逐漸減少趨勢(shì)(P<0.05)，見(jiàn)表2，圖1。

2.5DM組大鼠胰腺體尾部血液灌注量與血糖、血脂呈負(fù)相關(guān)(r=-0.725,r=-0.893)(P<0.05)。

表1 各組大鼠血糖變化±s,n=10)

表2 各組大鼠TG、血液灌流量變化±s，n=10)

圖1 各組大鼠胰體尾部血液灌注量變化

3 討 論

胰腺微循環(huán)參與組織、細(xì)胞間的信息傳遞、物質(zhì)交換及能量代謝，是胰島β細(xì)胞賴以生存的基礎(chǔ)環(huán)境。胰島β細(xì)胞合成和分泌的胰島素，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)體內(nèi)各組織器官的靶細(xì)胞，與特異性受體結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)作用，胰島微循環(huán)障礙勢(shì)必導(dǎo)致胰島分泌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的異常，誘發(fā)及加重T2DM的發(fā)生、發(fā)展。

既往研究表明〔1〕，動(dòng)物模型出現(xiàn)T2DM時(shí)，胰腺的微循環(huán)已有了變化。使用微循環(huán)顯微鏡對(duì)STZ所致T2DM模型大鼠進(jìn)行活體胰腺微循環(huán)觀察發(fā)現(xiàn)：胰島毛細(xì)血管排列失去絲球狀構(gòu)型，毛細(xì)血管數(shù)減少，走行紊亂，微血管管徑變細(xì)，凹凸不平，并有不同程度的出血。Enghofer等〔1〕應(yīng)用體內(nèi)熒光顯微技術(shù)觀察注射STZ后大鼠胰島微循環(huán)狀況，發(fā)現(xiàn)注射STZ 1 h后MCP增加，3 h后胰島血流速度顯著降低，提示STZ造成嚴(yán)重的胰島微循環(huán)紊亂。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠不同病程胰腺體尾部血流量無(wú)明顯變化。T2DM組大鼠成膜后0、4、8、12、16 w，胰體尾部血液灌注量顯著低于對(duì)照組。與既往的報(bào)道一致。

隨著T2DM病程的進(jìn)展，老齡DM大鼠胰體尾血液灌注量呈逐漸減少趨勢(shì)。其原因?yàn)椋孩僖认傥h(huán)境中的糖、脂代謝紊亂等循環(huán)障礙導(dǎo)致、加重β細(xì)胞功能損傷和凋亡；老齡T2DM大鼠成模后血糖處于逐漸升高狀態(tài)〔2〕，血糖是引發(fā)T2DM微循環(huán)障礙并促使其發(fā)展的重要原因之一，血糖升高后使毛細(xì)血管開(kāi)放減少，導(dǎo)致組織器官的血流灌注不足，造成器官功能障礙〔3，4〕。脂代謝紊亂，TG升高，促使血管硬化，血管彈性下降，使胰腺微血管內(nèi)膜粗糙增厚及退行性改變，造成血小板聚集；同時(shí)高血脂可改變紅細(xì)胞膜構(gòu)成，引起紅細(xì)胞變形、攜氧能力下降，最終導(dǎo)致胰腺微區(qū)血流灌注減少，引發(fā)微循環(huán)障礙。本實(shí)驗(yàn)觀察到血糖及血脂隨著病程延長(zhǎng)，呈逐漸升高趨勢(shì)，胰腺體尾部血液灌注量與血糖、血脂呈負(fù)相關(guān)，所以，胰腺體尾部血流量呈逐漸減少態(tài)勢(shì)。②老齡T2DM大鼠處于高血糖水平〔5〕，高血糖可造成內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞功能受損，干擾內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生血管活性物質(zhì)如一氧化氮(NO)等代謝，最后導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管舒張功能受損和區(qū)域的微循環(huán)障礙。血糖越高，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NO的代謝影響越大，使NO合成減少，血管處于收縮狀態(tài)，胰腺血流減少。另一方面〔6〕，胰島素通過(guò)活化內(nèi)皮一氧化氮合酶(NOS)，NO合成增多，使胰島微血管舒張，導(dǎo)致胰島血液灌注增強(qiáng)。老齡糖尿病大鼠β細(xì)胞受損嚴(yán)重，成模時(shí)胰島素即分泌減少，對(duì)內(nèi)皮NO的合成產(chǎn)生抑制作用，使胰島微血管處于收縮狀態(tài)，胰島血流灌注減少，且隨病程延長(zhǎng)，胰島素分泌逐漸減少，胰腺體尾部血液灌注亦逐漸減少。

微循環(huán)障礙不僅在T2DM發(fā)病前的胰島素抵抗期就已存在，而且貫穿于T2DM發(fā)生、發(fā)展的全過(guò)程。近年來(lái)，60歲以上老年人DM的發(fā)病率已高達(dá)20%，老齡T2DM與微循環(huán)的關(guān)系研究也日益受到關(guān)注。胰腺微循環(huán)是周身器官微循環(huán)的一部分，本實(shí)驗(yàn)顯示，老齡T2DM大鼠由于生理功能衰退，更早出現(xiàn)胰腺β細(xì)胞功能衰竭，胰腺血流灌注減少。T2DM大鼠微血管中的血流灌注減少，即使組織器官的氧供明顯下降，又可導(dǎo)致白細(xì)胞激活，血流淤滯，最終形成微血栓。所以，研究老齡T2DM大鼠的胰腺微循環(huán)改變，對(duì)探討老齡糖尿病的發(fā)病機(jī)制及指導(dǎo)治療具有重要的意義。

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