楊 成 陳名君 董 群

(皖南醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

自由基清除劑可直接或間接清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，有效阻止或防止由于過(guò)多自由基而導(dǎo)致的氧化損傷，起到保護(hù)機(jī)體延緩衰老的作用〔1〕。因此，開(kāi)放與研究抗氧化劑具有重要的意義。而有關(guān)蟲(chóng)生真菌抗氧化活性的報(bào)道多集中在體外實(shí)驗(yàn)研究〔2～5〕，本實(shí)驗(yàn)采用體外與體內(nèi)相結(jié)合的方法對(duì)其擬青霉屬中的斜鏈擬青霉菌絲體粗提物進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1試劑、藥品、菌株 斜鏈擬青霉由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。蛋白胨10 g/L，葡萄糖40 g/L，酵母浸出粉10 g/L，蒸餾水1 000 ml。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)(購(gòu)自Sigma公司)，D-半乳糖(購(gòu)自博美生物公司)，考馬斯亮藍(lán)(購(gòu)自博美生物公司)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)，其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小鼠18～22 g，雌雄各半，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(蘇)2007-0001。

1.3方法

1.3.1斜鏈擬青霉菌絲體粗提物制備 采用上述SDAY液體培養(yǎng)基，以10%的接種量接入一級(jí)液體種子，置28 ℃ 真菌培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)25 d后洗滌抽濾，取洗滌后菌絲體65℃烘箱中烘干稱(chēng)重，以甲醇為提取溶劑，按質(zhì)量與提取劑體積之比1∶30(w/v)，超聲波提取4 h后離心收集上清，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃真空濃縮至干備用。

1.3.2斜鏈擬青霉菌絲體粗提物體外抗氧化實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)〔4，5〕方法，甲醇溶解樣品制成不同濃度1、2、4、8、16 mg/ml，取各濃度樣品100 μl和預(yù)先用95%乙醇配制的0.4 mg/ml的DPPH自由基100 μl于96孔酶標(biāo)板中，每個(gè)樣品重復(fù)3次。將加完后將酶標(biāo)板置酶標(biāo)儀中振動(dòng)30 s，37℃波長(zhǎng)517 nm測(cè)定其吸光值(Ap)，37℃保溫10 min再測(cè)定1次，同時(shí)測(cè)定不加DPPH自由基的樣品空白吸光值(Ac)和加DPPH自由基以甲醇代替樣品的吸光值(Amax)。計(jì)算相對(duì)自由基清除率。

1.3.3體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 參照文獻(xiàn)〔6～8〕方法，取昆明系小鼠35只，隨機(jī)分為5組，設(shè)正常組，模型組，藥物高、中、低劑量組，除正常組皮下注射生理鹽水外，其余4組125 mg·kg-1·d-1皮下注射D-半乳糖造模，同時(shí)對(duì)藥物組進(jìn)行灌胃給藥治療，高、中、低劑量組給予900、300、100 mg/kg，正常組和模型組給予等量蒸餾水，連續(xù)6 w。按常規(guī)眼球取血，加肝素抗凝后2 500 r/min 離心 10 min，取上清冷藏備用；斷頸處死，取出肝組織用冰生理鹽水洗滌去除血液，濾紙吸干，按肝組織重量/冰生理鹽水量比為1∶10的量制備肝組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清冷藏備用。

1.3.4小鼠血漿中SOD活力與肝組織中MDA含量的測(cè)定 取上述1.4中獲得的血漿和肝組織勻漿，分別按SOD活力試劑盒和MDA試劑盒測(cè)定其含量，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1斜鏈擬青霉菌絲體粗提物體外對(duì)DPPH自由基的清除活性 斜鏈擬青霉菌絲體粗提物具有清除DPPH自由基活性，且不同時(shí)間和各濃度對(duì)DPPH自由基的清除能力不同，清除活性隨樣品濃度的遞大而增強(qiáng)，終反應(yīng)10 min時(shí)樣品對(duì)0.4 mg/ml的DPPH自由基相對(duì)清除率IC50為1.81 mg/ml。見(jiàn)表1。

表1 粗提物對(duì)DPPH自由基的相對(duì)清除率(%)

2.2斜鏈擬青霉菌絲體粗提物對(duì)小鼠血漿SOD活性和肝組織中MDA含量的影響 表2可見(jiàn)，對(duì)與SOD活性，高劑量組、中劑量組與模型組比較，粗提物能明顯提高小鼠血清中SOD活性(P<0.05)。但給藥組與正常組比較差異不顯著(P>0.05)；對(duì)于MDA含量，模型組與正常組相比差異明顯(P<0.05)，高劑量組與正常組、模型組比較差異顯著(P<0.01)，而中劑量組、低劑量組與模型組比較，能明顯的降低MDA(P<0.01)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗氧化損傷的能力。

表2 粗提物對(duì)衰老小鼠SOD活性和MDA含量的影響±s，n=7)

3 討 論

衰老的自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為自由基攻擊生物膜中不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化作用，從而破壞細(xì)胞完整的膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)采用DPPH抗氧化活性體外評(píng)價(jià)體系對(duì)斜鏈擬青霉菌絲體粗提物體外清除自由基活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)利用給小鼠連續(xù)皮下注射大劑量D-半乳糖，造成其糖代謝紊亂，進(jìn)而被半乳糖氧化酶氧化產(chǎn)生超氧陰離子等氧自由基，攻擊膜磷脂中的不飽和脂肪酸。而MDA就是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，也使細(xì)胞膜蛋白發(fā)生交聯(lián)，進(jìn)一步加劇細(xì)胞結(jié)構(gòu)損害。除此之外，自由基還可以攻擊細(xì)胞中DNA和其他生物大分子而導(dǎo)致其損傷，引起機(jī)體衰老、癌癥等疾病。另一方面，機(jī)體內(nèi)的SOD具有清除自由基作用，提高機(jī)體抗氧化酶活性，可以抑制或清除機(jī)體內(nèi)過(guò)多的自由基，維持機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化之間的平衡起，因此，檢測(cè)這兩項(xiàng)指標(biāo)可以從一個(gè)側(cè)面反映了藥物在體內(nèi)的抗氧化效果〔9〕。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，斜鏈擬青霉菌絲體粗提物在體外對(duì)DPPH自由基具有很強(qiáng)的清除作用；在體內(nèi)，對(duì)于D-半乳糖所致的小鼠亞急性衰老模型，斜鏈擬青霉菌絲體粗提物既能提高其血漿中SOD活性，又降低肝組織中MDA含量，因而，顯示出較好的抗氧化活性。

4 參考文獻(xiàn)

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