王巖峰 秦光華 張玉強(qiáng) 楊明超 王 喆

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

脊髓原發(fā)性損傷后的繼發(fā)性損傷擴(kuò)大了損傷范圍，加重了損傷程度，是脊髓損傷后影響脊髓修復(fù)的重要病理過(guò)程。脊髓繼發(fā)性損傷的過(guò)程十分復(fù)雜，包括水腫、炎癥反應(yīng)、局部缺血、谷氨酸受體過(guò)度激活、脂質(zhì)過(guò)氧化作用、鈣離子超載等，但是目前尚無(wú)一個(gè)公認(rèn)的關(guān)于脊髓損傷后繼發(fā)傷的病理機(jī)制。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)對(duì)神經(jīng)元的生存、分化、生長(zhǎng)起重要作用。腺病毒介導(dǎo)BDNF基因移植可促進(jìn)SCI 后紅核脊髓神經(jīng)元再生和修復(fù),能激活再生相關(guān)基因表達(dá)〔1〕。SCI后,BDNF在損傷局部升高,可以促進(jìn)脊髓神經(jīng)元和軸突的再生〔2〕。Ikeda 等〔3〕發(fā)現(xiàn),鞘內(nèi)注射BDNF可提高SCI急性期內(nèi)Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)和髓鞘堿性蛋白(MBP)在脊髓神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中的活性,從而對(duì)脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)起積極作用。Bcl-2屬于抑制細(xì)胞凋亡基因。潘磊等〔4〕研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2 蛋白不僅在Wistar成年大鼠神經(jīng)元中提高表達(dá)；更多在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),同時(shí)降低Bax的表達(dá)；BBB評(píng)分表明,神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯減少,大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)明顯。國(guó)外有學(xué)者證實(shí)MP療法增強(qiáng)SCI 功能恢復(fù)的機(jī)制之一為提高Bcl-2 表達(dá)和抑制Bax 表達(dá)〔5〕。但是，外源性BDNF能否通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)參與急性脊髓損傷的發(fā)病機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)各組大鼠Bcl-2的表達(dá)，為治療脊髓損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 羊抗大鼠Bcl-2、β-actin多克隆抗體(Santa- Cruz,CA);兔抗羊IgG、S-P免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(福州邁新)。

1.2大鼠急性脊髓損傷動(dòng)物模型的建立及分組 取健康成熟Wistar大鼠72只，雌雄不限，體重220～250 g,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為對(duì)照組，損傷組，BDNF組。模型制備：10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉，無(wú)菌原則下進(jìn)行背正中切口，切除T8、T9椎板，暴露硬脊膜。按Nystrom法將35 g重物通過(guò)2.2 mm×5 mm弧形光滑金屬墊片壓迫該段脊髓后正中部5 min，分層縫合，碘伏消毒。脊髓損傷后分6、12 h，1、3、7 d 共5個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只；BDNF組:損傷后，立即向硬脊膜下腔內(nèi)注射BDNF，分為6、12 h，1、3、7 d共5個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只；空白對(duì)照組8只，只做T9～T10椎板切除術(shù)。

1.3免疫組化 各組大鼠分別于脊髓損傷后各時(shí)間點(diǎn)取材，麻醉后剖胸，經(jīng)左心室-主動(dòng)脈插管，4%多聚甲醛灌流固定。以傷處為中心取1.5 cm脊髓組織，多聚甲醛浸泡固定。常規(guī)蠟塊包埋，連續(xù)切片數(shù)張(縱切)，片厚6 μm，每只大鼠取12張切片，按SP試劑盒說(shuō)明書測(cè)定Bcl-2的表達(dá):常規(guī)脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫處理、高溫修復(fù)、血清封閉、滴加一抗過(guò)夜(濃度均為1∶150),并同時(shí)用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，4 ℃孵育過(guò)夜、隔日滴加二抗孵育20 min、SABC 37℃孵育20 min，繼而二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,鏡下觀察顯色背景。以上各步驟間均用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，而后蘇木素復(fù)染，蒸餾水沖洗，梯度酒精逐級(jí)脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡觀察脊髓組織變化。

1.4Western 印跡免疫蛋白印跡 動(dòng)物以10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔內(nèi)注射，麻醉后，各時(shí)間點(diǎn)分別取4只動(dòng)物，直視下取出距損傷中心區(qū)上下各0.5 cm兩段脊髓，置于裂解液中機(jī)械勻漿，4 ℃ 17 000 r/min離心1 h，吸出上清液，棄去沉淀。用考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合法，根據(jù)已知牛血清白蛋白溶液的濃度及其吸光度和樣品吸光度計(jì)算出樣品蛋白濃度和加樣量。加入樣品緩沖液，然后將樣品置于沸水浴中加熱5 min使蛋白質(zhì)變性。將制備好的樣品置于-20℃冰箱備用。制備12%分離膠，4%濃縮膠，用微量加樣器將樣品加在凝膠表面樣品槽中。電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉TTBS緩沖液4℃過(guò)夜。一抗Bcl-2、β-actin(1∶200)室溫孵育2 h，洗膜，辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000,Santa Cruz)室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL試劑( Santa Cruz)反應(yīng)1 min，暗室曝光顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)上攝像分析，測(cè)得目標(biāo)帶的IDV，進(jìn)而計(jì)算出各組樣品Bcl-2目標(biāo)帶的IDV與內(nèi)參照β-actin IDV的比值。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化結(jié)果 從免疫組化圖片上可以看出，對(duì)照組Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)較少(11.06±0.65)。損傷組在手術(shù)后6 h開始出現(xiàn)大量的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞凋亡,與對(duì)照組相比，Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)，并在3 d時(shí)達(dá)到峰值;而在之后逐漸減少，但在7 d時(shí)仍有一定數(shù)量的Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞。而相比于實(shí)驗(yàn)組的各時(shí)間點(diǎn)，BDNF組的大鼠脊髓Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)明顯低于損傷組。見圖1，表1。

2.2Western 印跡結(jié)果 與對(duì)照組相比(0.08±0.01)，脊髓損傷組大鼠損傷后6、12 h，1、3、7 d的Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.05)，且逐漸上升，3 d達(dá)高峰，而在之后逐漸減少，但在7 d時(shí)仍有大量表達(dá)；BDNF組6、12 h，1、3、7 d時(shí)間點(diǎn)的大鼠脊髓Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)明顯低于損傷組(圖2，表1)。

圖1 免疫組化方法檢測(cè)各組小鼠Bcl-2蛋白的表達(dá)(×200)

表1 各組小鼠Bcl-2蛋白光密度值及NF-κB灰度值比較±s,n=4)

圖2 Western印跡方法檢測(cè)各組小鼠Bcl-2和 β-actin蛋白表達(dá)

3 討 論

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為,脊髓損傷后神經(jīng)元和軸突不可再生,其主要原因是損傷局部環(huán)境缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和誘導(dǎo)軸突再生的蛋白因子〔6〕。但有研究發(fā)現(xiàn),SCI后脊髓神經(jīng)元和軸突仍具有一定的再生能力,但這種再生需要有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NTFs)的營(yíng)養(yǎng)支持〔7〕。BDNF是NTFs家族中的成員之一,對(duì)神經(jīng)元的生存、分化、生長(zhǎng)起重要作用〔8〕。SCI后,BDNF在損傷局部的升高,可以促進(jìn)脊髓神經(jīng)元和軸突的再生〔9〕,目前已成為SCI 研究中的熱點(diǎn)之一。

Bcl-2主要位于線粒體外膜、核被膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,可抑制細(xì)胞凋亡基因。有研究證實(shí),米諾環(huán)素能提高SCI后神經(jīng)功能恢復(fù),其作用是增加Bcl-2 的表達(dá),從而提高Bcl-2/ Bax 的比值,減少神經(jīng)細(xì)胞走向凋亡,進(jìn)而保護(hù)損傷的脊髓神經(jīng)組織〔10〕。王金光等〔11〕證實(shí)β-七葉皂甙鈉改善血循環(huán),中止SCI 繼發(fā)性損傷,抑制脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥表達(dá)的機(jī)制之一是上調(diào)Bcl-2 表達(dá)；還有研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物( EGb)能抑制SCI后細(xì)胞凋亡,在運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)、損傷脊髓組織保護(hù)上發(fā)揮其有益作用,其機(jī)制之一也是上調(diào)Bcl-2 和下調(diào)Bax 基因表達(dá)〔12～14〕。

本實(shí)驗(yàn)提示外源性BDNF很可能是通過(guò)上調(diào)Bcl-2的表達(dá)來(lái)參與急性脊髓損傷的發(fā)病機(jī)制的。

4 參考文獻(xiàn)

1Kwon BK,Liu J,Lam C,etal.Brain-derived neurotrophic factor gene transfer with adreno-associated viral and lentiviral vectors prevent srubro spinal neuronal atrophy and stimulates regeneration-associated gene expression after cute cervical spinal cord injury 〔J〕.Spine,2007;32(11):1164 - 73.

2Gulino R,Lombardo SA,Casabona A,etal.Leve ls of brain-de rived neurotrophic factor and neurotrophin-4 in lumbar motoneurons after low-thoracic spinal cord hemisection 〔J〕.Bra in Res,2004;1013(2):174-81.

3Ikeda O,Murakami M,Ino H,etal.Effects of BDNF on compression induced spinal cord injury:BDNF attenuates down-regulation of superoxide dismutase expression and promotes upregulation of myelin basic protein expression〔J〕.Neuropathol Exp Neurol,2002;61:142-53.

4潘 磊,呂國(guó)華,雷 高,等.大劑量甲基強(qiáng)的松龍對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007；26(5):271-4.

5Kim YT,Caldwell JM,Bellamkonda RV.Nanoparticle mediated local delivery of methylprednisolone after spinal cord injury 〔J〕.Biomaterials,2009;30(13):2582 - 90.

6Weidner N,Grill RJ,Tuszynski MH.Elimination of basal lamina and the collagen “Scar” afte r spinal cord injury fails to augment c rticospinal tract regeneration 〔J〕.Exp Neuro,1999;160( 1):40- 50.

7Widenfalk J,Lundstromer K,Jubran M,etal.Neurotrophic factor and receptor in the immature and adult spinal cord after mechanical injury or kainic acid 〔J〕.J Neurosci,2001;21:3457-75.

8Lamballe F,Klein R,Barbcaid O.TrkC,a new member of the trk family of tyrosine protein kinases,is a receptor for neurotrophin〔J〕.Cell,1991;66(5):967-79.

9Gulino R,Lombardo SA,Casabona A,etal.Levels of brain-de rived neurotrophic factor and neurotrophin-4 in lumbar motoneurons after low-thoracic spinal cord hemisection〔J〕.Brain Res,2004;1013(2):174-81.

10Cheng G,Liang Q,Chen AM,etal.Effect of minocycline on expression of Bcl2,Bax and Bcl2xl in rats with spinal cord injury〔J〕 .Chin J Clin Rehabil,2006;10(24):181-3.

11王金光，鄭啟新，郭曉東，等.應(yīng)用β-七葉皂甙鈉治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志， 2005；2(1):15-17,80.

12Ao Q,Sun XH,Wang AJ,etal.Protective effects of extract of Ginkgo biloba(EGb 761)on nerve cells after spinal cord injury in rats 〔J〕 .Spinal Cord,2006;44(11):662-7.

13張 烽,馮煒煒,周海濤.銀杏葉提取物對(duì)大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的作用及其機(jī)制〔J〕.中國(guó)脊柱脊髓雜志，2007；17(9):675-9.

14樊立宏,王坤正,程 斌.銀杏葉提取物對(duì)兔脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2006；4(2):181-4.