秦寧寧 王秋月

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病重要的慢性并發(fā)癥，最終可以引發(fā)腎衰竭。目前DN治療主要是控制血糖和血壓，但并不能阻止腎病的發(fā)生和發(fā)展。免疫和炎癥反應(yīng)在DN的過(guò)程中起著重要的作用。Toll樣受體4(TLR4)是一種Toll樣受體，識(shí)別內(nèi)毒素-脂多糖(LPS)及熱休克蛋白(HSP)等內(nèi)源性配體，激活核因子-κB(NF-κB)啟動(dòng)炎性因子的轉(zhuǎn)錄和合成，最終釋放大量的炎性因子，參與炎性反應(yīng)〔1,2〕。本研究擬通過(guò)觀察DN患者腎小管的病理變化，分析TLR4的表達(dá)改變與炎癥因子表達(dá)的關(guān)系，旨在探討TLR4及炎癥因子表達(dá)的關(guān)系在DN中的作用。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 2011年9月至2013年12月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腎內(nèi)科住院經(jīng)臨床和腎活檢確診為DN的患者27例。其中男12例，女15例，年齡41～64歲。尿蛋白含量均>500 mg/d。并將DN組患者根據(jù)尿蛋白定量分為低蛋白尿組(0.5～2g/d)和高蛋白尿組(>2 g/d)。均符合1999年WHO、IDF公布的糖尿病及DN診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組為同期本院泌尿外科腎癌根治術(shù)患者10例，其中男6例，女4例，年齡37～62歲。并取腎臟遠(yuǎn)離腫瘤組織未被浸潤(rùn)的病理診斷為正常的腎組織。所有對(duì)象均排除高血壓、急性感染、吸煙等干擾因素，無(wú)年齡、性別等統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2試劑 免疫組化試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；兔抗人TLR4多克隆抗體(美國(guó)santa cruz公司)；兔抗人單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)多克隆抗體(美國(guó)santa cruz公司)；兔抗人白細(xì)胞介素(IL)-18多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)。

1.3儀器 全自動(dòng)生化分析儀(日本HITACHI公司)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)leica公司)；-20℃冰箱(日本HITACHI公司)；恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械七廠)。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法 于腎活檢前1天收集DN患者血、尿標(biāo)本，術(shù)前收集對(duì)照組患者血、尿標(biāo)本。常規(guī)生化方法檢測(cè)24 h尿蛋白定量、血清肌酐(Scr)。免疫組化法檢測(cè)各組腎組織標(biāo)本的TLR4、MCP-1、IL-18的表達(dá)，常規(guī)石蠟制片、切片、脫蠟。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 min，3次，過(guò)氧化氫孵育10 min，PBS液沖洗，1%Triton-100浸泡10 min，封閉，加入一抗，孵育12 h，PBS液沖洗，加入二抗孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色10 min，復(fù)染，脫水，封片。

1.5半定量表達(dá)評(píng)估 對(duì)腎小管上皮細(xì)胞TLR4、MCP-1、IL-18表達(dá)著色面積的評(píng)分，計(jì)數(shù)各抗原呈陽(yáng)性表達(dá)的腎小管上皮細(xì)胞占上皮細(xì)胞總數(shù)的百分率，分值設(shè)為0～4分，0分無(wú)陽(yáng)性表達(dá)；1分弱表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞率<25%；2分中表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞率占25%～50%；3分為高表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞率占51%～70%；4分為強(qiáng)表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞率占70%以上。每張切片隨機(jī)選取20個(gè)視野(×100倍)，計(jì)算20個(gè)視野的評(píng)分值取平均值，得到各抗原的表達(dá)計(jì)分。

2 結(jié) 果

2.1各組尿蛋白定量、Scr等臨床指標(biāo)的測(cè)定 DN組與對(duì)照組比較，年齡性別均無(wú)顯著性差異。DN組患者的24 h尿蛋白定量及Scr水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床指標(biāo)比較±s)

2.2腎組織中TLR4、MCP-1、IL-18的表達(dá) 對(duì)照組腎組織上皮細(xì)胞TLR4無(wú)表達(dá)，MCP-1、IL-18基本無(wú)表達(dá)。DN組TLR4、MCP-1、IL-18在腎小管上皮細(xì)胞胞漿顯棕黃色，明顯為高表達(dá)，與對(duì)照組比較，DN組患者腎小管上皮細(xì)胞TLR4、MCP-1、IL-18的表達(dá)顯著升高(P<0.01)。DN組中高蛋白尿組的各項(xiàng)評(píng)分明顯高于低蛋白尿組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組檢測(cè)腎組織中TLR4、MCP-1、IL-18的表達(dá)(×400)

2.3腎組織中TLR4的表達(dá)與各炎性因子及臨床指標(biāo)的關(guān)系 DN組TLR4的表達(dá)水平與MCP-1、IL-18、24 h尿蛋白定量及Scr水平呈顯著正相關(guān)(R=0.683 39,0.613 31,0.645,0.571 2，P<0.05)。

3 討 論

DN是糖尿病重要的并發(fā)癥之一，其最終都會(huì)引發(fā)腎衰竭。其發(fā)病機(jī)制可能是病人在高血糖狀態(tài)下機(jī)體氧化應(yīng)激、腎血流動(dòng)力學(xué)因素的改變等因素相互作用的結(jié)果〔3〕。現(xiàn)在的臨床治療對(duì)DN只有延緩病情的作用，不能阻止其發(fā)展至終末期腎衰竭。糖尿病為一種代謝紊亂引起的慢性炎癥疾病，炎性因子是促進(jìn)糖尿病并發(fā)癥的主要因素。DN的病理生理過(guò)程都有炎癥的參與，且對(duì)病程的進(jìn)展起著決定性的因素〔4〕。本研究結(jié)果提示蛋白尿在DN引起的腎小管間質(zhì)炎癥中起著重要的作用。TLR4作為一種巨噬細(xì)胞受體，是免疫反應(yīng)上游的重要調(diào)節(jié)因子，在高糖環(huán)境下，激活NF-κB,進(jìn)而調(diào)節(jié)MCP-1等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)〔5〕。本實(shí)驗(yàn)顯示，DN組TLR4高表達(dá)，TLR4信號(hào)通路激活，促進(jìn)了MCP-1炎性因子的釋放，提示DN患者的腎小管上皮細(xì)胞中MCP-1的產(chǎn)生于TLR4受體通路有關(guān)。在眾多炎性因子中，IL-18對(duì)DN的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用〔6〕，本實(shí)驗(yàn)還表明DN患者體內(nèi)的高糖信號(hào)通過(guò)激活TLR4信號(hào)通路，使相關(guān)受體活化，誘導(dǎo)IL-18等炎性因子釋放，進(jìn)入促進(jìn)腎間質(zhì)炎性的產(chǎn)生及發(fā)展。炎癥是推進(jìn)DN發(fā)展的重要因素，而尿蛋白量是判定DN炎癥損傷的最敏感性指標(biāo)。TLR4的表達(dá)與DN的關(guān)系尿蛋白及相關(guān)炎性因子與TLR4表達(dá)的密切相關(guān)性，對(duì)探索DN發(fā)生、發(fā)展的病理機(jī)制提供新的靶點(diǎn)。

4 參考文獻(xiàn)

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2Michelsen KS,Doherty TM,Shah PK,etal.TIR signaling: an emerging bridge from innate immunity to atherogenesis〔J〕.J Immunol,2004;173(10):5901-7.

3Schmitz J,Owyang A,Oldham E,etal.IL-33 an interleukin-1 like cytokine that signals via the IL-1 receptor related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines〔J〕.Immunity,2005;23(5): 479-90.

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5Amann B,Tinzmann R,Angelkort B.ACE inhibitors improve diabetic Nephropathy through suppression of renal MCP-1〔J〕.Diabetes Care,2003;26(8): 2421-5.

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