張玉國(guó) 李 銳

(青海省中醫(yī)院醫(yī)療服務(wù)監(jiān)管科，青海 西寧 810000)

冠心病(CHD)也是一種重要的遺傳性疾病，因此鑒定參與CHD病理過程的相關(guān)基因是目前研究的熱點(diǎn)問題之一〔1〕。目前已經(jīng)證實(shí)降低血清總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)已成為防治心血管疾病有效手段之一〔2〕。細(xì)胞內(nèi)膽固醇動(dòng)態(tài)平衡的維持主要依賴兩種調(diào)節(jié)機(jī)制:細(xì)胞外LDL受體攝取外源性膽固醇和內(nèi)源性膽固醇合成，后者由羥甲基戊二酸-輔酶A還原酶(HMGCR)催化完成〔3〕。HMGCR是膽固醇合成的限速酶，受甲羥戊酸代謝產(chǎn)生的甾醇和非甾醇調(diào)控。在正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，該酶主要受到LDL受體活化過程中分解成的膽固醇的抑制，可引起血漿LDL濃度上升。他汀類藥物是HMGCR的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，能夠通過膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)調(diào)控血漿膽固醇的水平，從而降低心血管病的發(fā)病率和死亡率。但是，不同個(gè)體對(duì)他汀藥物的反應(yīng)不一，關(guān)于HMGCR基因多態(tài)性的研究已有一些報(bào)道〔4,5〕。本研究旨在探討HMGCR-911多態(tài)性的對(duì)不同年齡和性別的CHD病人及健康人群對(duì)照血清膽固醇水平的影響。

1 對(duì)象和方法

1.1病例選擇 365例在我院心內(nèi)科就醫(yī)的CHD病人，納入標(biāo)準(zhǔn)為：通過血管造影術(shù)對(duì)CHD明確診斷，根據(jù)WHO的診斷標(biāo)準(zhǔn)：粥樣硬化造成至少其中一支冠狀動(dòng)脈狹窄50%。排除標(biāo)準(zhǔn)為，有心肌損傷病史，做過經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)及冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)的患者，有嚴(yán)重的肝硬化、腎功能不全，代謝綜合征、惡性腫瘤及精神疾病的患者。選擇體檢健康無心血管病史的365人為對(duì)照(未進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影，因此不能排除部分人有粥樣動(dòng)脈硬化)。進(jìn)行問卷調(diào)查，主要是冠狀動(dòng)脈風(fēng)險(xiǎn)因子，包括吸煙、冠狀動(dòng)脈家族史、高血壓、糖尿病、高血脂等。經(jīng)我院倫理委員會(huì)通過，所有步驟都符合赫爾辛基宣言關(guān)于“人體醫(yī)學(xué)研究倫理守則”的相關(guān)規(guī)定，所有參與者在采血前都簽署了知情同意書。TC/HDL-C比值作為評(píng)估心血管病風(fēng)險(xiǎn)因子比TC更為有效(TC/HDL-C男性≤4.5，女性≤4.0)。

1.2基因型檢測(cè) 用EDTA抗凝的采血管采集受試對(duì)象的血樣，然后用SDS醋酸裂解乙醇沉淀商業(yè)試劑盒(Roche Diagnositic，美國(guó))提取白細(xì)胞基因組DNA，樣品存于4℃，用Tris-EDTA溶解。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以及限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析-911C>A多態(tài)性。引物為5′-TTGAGTGAAATACAGATCCTGTCC-3′/5′-CCATAGACCTGCATCAGCGT-3′。PCR反應(yīng)體系：PCR緩沖液10 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，MgCl21.5 mmol/L，引物(0.8 pmol/μl)和1 U Taq酶。循環(huán)參數(shù)：96℃，5 min；96℃，45 s；56℃，45 s；72℃終止；30個(gè)循環(huán)。隨后，用BsuRI消化(MBI Fermentas，意大利； 10 U/樣品)。2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色，紫外光下對(duì)凝膠圖像拍照記錄。根據(jù)以下片段分析基因型：長(zhǎng)片段261和139 bp(AA基因型)；261，70，69 bp(CC基因型)，261，139，70，69 bp(AC基因型)，采用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)20個(gè)代表性樣本的HMGCR-911多態(tài)性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t或Mann-WhitneyU、χ2檢驗(yàn)。采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算等位基因頻率，χ2檢驗(yàn)分析Hardy-Weinberg平衡分離度。應(yīng)用二元邏輯回歸(LR)進(jìn)行多因素分析，通過優(yōu)勢(shì)比(OR)和置信區(qū)間(CI)計(jì)算相對(duì)危險(xiǎn)度。

2 結(jié) 果

2.1患者一般情況 對(duì)照組和CHD組年齡、性別無顯著差異(P>0.05)。CHD組高血壓31例(85.4%)，無糖尿病患者，兩組家族史無顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較，CHD組患動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)因子顯著升高，包括體重指數(shù)(BMI)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、TC，極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)、吸煙比例均高、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平低(P均<0.001)。女性CHD組平均年齡大于男性CHD組(P<0.001)，SBP水平升高(P<0.01)，吸煙比例較少(P<0.001)。女性對(duì)照組年齡也明顯大于男性組(P<0.001)，BMI(P<0.001)，SBP(P<0.01)，DBP(P<0.05)明顯高于男性組(表1)。

2.2HMGCR-911C>A基因型和等位基因分布 兩組HMGCR-911C>A多態(tài)性有顯著差異(P<0.05)。對(duì)照組CA頻率明顯高于CHD組(OR：0.650，95%CI：0.435～0.970，P=0.034)。對(duì)照組HMGCR-911符合Hardy-Weinberg平衡(HWE)；而CHD組HWE發(fā)生偏移。見表2。

表1 各組基本信息、生化指標(biāo)和臨床特征±s)

表2 HMGCR基因型以及等位基因在人群中的分布〔n(%)〕

女性CHD組HMGCR-911同源CC基因型頻率顯著高于女性對(duì)照組，而A等位基因頻率低于女性對(duì)照組(OR：3.169，95%CI：1.468～6.842，χ2=9.226,P=0.002，統(tǒng)計(jì)效能=92.4%)。女性對(duì)照組中CA基因頻率顯著高于女性CHD組(OR:0.283,95%CI:0.122～0.652,P=0.002)。男性HMGCR-911多態(tài)性基因頻率無顯著差異(P>0.05)。男性CHD組A等位基因(CA+AA基因型)頻率是女性的2.3倍(OR:2.322,95%CI:1.132～4.764,χ2=5.511,P=0.019)，而對(duì)照組中男性和女性無差異。見表3。

2.3HMGCR -911C>A多態(tài)性同脂質(zhì)及代謝參數(shù)的關(guān)系 男性CHD組CC基因型患者血清TC和LDL-C水平高于CA+AA基因型(P=0.003，統(tǒng)計(jì)效能=95%；P=0.018，統(tǒng)計(jì)效能=83%)。男性HMGCR-911CC基因型CHD組同HMGCR-911CA+AA基因型相比，TC/HDL-C比值高(5.33±1.58 vs.4.63±1.50,P=0.004)，而女性CHD組HMGCR-911基因型該比值無差異(4.95±1.60 vs.4.97±1.77,P=0.976)。對(duì)照組男性和女性HMGCR-911基因型無差別(男性CC:4.10±1.53 vs. CA+AA: 4.47±1.74,P=0.171；女性CC：4.19±2.05 vs. CA + AA: 3.58±1.28,P=0.140)，HMGCR-911C>A多態(tài)性對(duì)TC無影響。CHD家族史同HMGCR-911多態(tài)性無關(guān)。見表4。

2.4多因素回歸分析 多因素邏輯回歸分析評(píng)估CHD患病組中HMGCR-911多態(tài)性與性別、年齡(<55歲，>55歲)、TC(血清膽固醇>5.18 mmol/L,<5.18 mmol/L)的關(guān)系。在多因素回歸模型中，男性中，因變量HMGCR CC 基因型同年齡<55歲〔OR=3.832;95%CI=1.898～7.734;P=0.000〕和TC≥ 5.18 mmol/L〔OR=3.001;95%CI=1.486～6.06;P=0.002〕顯著相關(guān)，但在女性中則無相關(guān)性(P>0.05)。邏輯回歸分析表明，在年齡<55歲的CHD患者HMGCR-911 CC基因型同TC升高顯著相關(guān)。

表3 不同性別HMGCR -911 C>A多態(tài)性〔n(%)〕

表4 HMGCR -911 C>A多態(tài)性對(duì)兩組不同性別脂類代謝的作用±s)

3 討 論

HMGCR是一種由888個(gè)氨基酸組成的膜糖蛋白，是體內(nèi)膽固醇合成的限速酶，其抑制劑(如他汀類藥物)能降低其活性，誘導(dǎo)LDL受體基因表達(dá)，有效地使血漿膽固醇水平下降。研究〔6〕發(fā)現(xiàn)在HMGCR基因存在的多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，HMGCR rs3846662單核苷酸多態(tài)性(SNP)對(duì)血清LDL-C水平影響較大，而且也會(huì)影響到血清脂類物質(zhì)水平對(duì)普伐他汀的反應(yīng)。Freitas等〔7〕進(jìn)行了大范圍的調(diào)查研究(包括597例亞裔美國(guó)人，627例華裔美國(guó)人，612例歐裔美國(guó)人，608例西班牙裔美國(guó)人)，分析不同種族在使用了他汀類藥物后對(duì)脂質(zhì)和脂蛋白吸收的反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HMGCR基因多態(tài)性對(duì)甘油三酸酯、LDL、HDL-C有明顯影響。研究還發(fā)現(xiàn)〔8〕，HMGCR-911啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性也是發(fā)生急性心肌梗死(AMI)的一種危險(xiǎn)因素，Jawaid等〔9〕報(bào)道了HMGCR-911 CC基因型同AMI及復(fù)發(fā)有關(guān)，同時(shí)觀察到老年人BMI值高及TC含量高同HMGCR CC基因型有關(guān)。

本調(diào)查發(fā)現(xiàn)CC基因型等位基因的分布和意大利人(11.0%)〔10〕和瑞士人群(10.23%)〔11〕基本一致。本研究表明HMGCR-911 CC基因型與男性CHD患病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，受年齡和性別的影響。雌激素對(duì)膽固醇代謝有明顯影響，男性中雌激素受體少于女性，因此HMGCR -911多態(tài)性對(duì)細(xì)胞蛋白固醇的水平可能有不同影響。女性雌激素隨著年齡的增長(zhǎng)而降低，由于55歲以上的女性雌激素受水平基本不變，因此HMGCR-911多態(tài)性可能還會(huì)受到年齡的影響。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HMGCR基因啟動(dòng)子區(qū)受雌激素調(diào)控，已鑒定到多個(gè)HMGCR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)〔12〕。其中之一是位于293區(qū)(Red-ERE)雌激素反應(yīng)性原件相似序列。Medina等〔13〕推測(cè)該組織HMGCR受雌激素特異性調(diào)控，可能會(huì)對(duì)心臟病的發(fā)生有預(yù)防作用。因?yàn)槟行曰颊咧袥]有雌激素，因此對(duì)于膽固醇受HMGCR基因-911啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性的影響很小。而女性患者CC基因型則可保護(hù)機(jī)體免受高膽固醇的損傷，因而可減少CHD的發(fā)生。

HMGCR酶是他汀類藥物的作用靶點(diǎn)，因此不同HMGCR-911 C>A多態(tài)性對(duì)他汀類藥物個(gè)體化用藥有一定的指導(dǎo)作用〔14〕。本研究表明HMGCR-911多態(tài)性對(duì)不同性別和年齡患者的血清TC水平及發(fā)生CHD風(fēng)險(xiǎn)有不同影響，但該基因多態(tài)性同血清中雌激素水平、脂質(zhì)譜、HMGCR和SNP功能的關(guān)系〔15〕還需長(zhǎng)期研究。

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