孫井軍

(中國石化集團(tuán)勝利石油管理局勝利醫(yī)院普外科，山東 東營 257000)

細(xì)胞正常生長依賴于細(xì)胞周期素(Cyclin)、Cyclin依賴激酶(CDKs)和CDK抑制蛋白的平衡調(diào)控〔1〕。Cyclin結(jié)合并活化CDKs調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中的關(guān)鍵節(jié)點，使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期〔2〕。機(jī)體內(nèi)同時存在多種CDKs的抑制蛋白，包括p16INK4a、p15INK4b、p18INK4c、p21CIP1和p27KIP1等，抑制細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。由D型Cyclin調(diào)控的細(xì)胞周期通路是腫瘤細(xì)胞中最常見的突變通路〔3〕。CyclinD1過度表達(dá)和p16、p27功能喪失會導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，誘發(fā)腫瘤。本研究旨在探討CyclinD1、p16及p27的表達(dá)在胃腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，評估其作為腫瘤標(biāo)志物對胃腺癌患者預(yù)后的意義。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 我院病理科2008年6月至2013年6月手術(shù)切除的原發(fā)胃腺癌標(biāo)本122例，年齡32～79(平均55.6)歲。TNM分期Ⅰ期9例，Ⅱ期35例，Ⅲ期56例，Ⅳ期22例。手術(shù)時均未接受過任何放化療。

1.2組織芯片制作 復(fù)查所有病例的腫瘤和癌旁HE切片，顯微鏡下選取腫瘤區(qū)及癌旁區(qū)，用筆圈出采點位置。取每位患者腫瘤組織2個組織點和癌旁組織1個組織點，用組織芯片儀制作成組織芯片蠟塊，共366個位點。芯片蠟塊以5 μm厚度連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色，由病理科醫(yī)師再次確認(rèn)病理診斷結(jié)果。

1.3免疫組化染色 切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后，用3%過氧化氫(H2O2)溶液室溫下封閉內(nèi)源性過氧化物酶20 min后在檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中進(jìn)行抗原微波熱修復(fù)15 min，待自然冷卻后取出，PBS液洗滌3遍。正常山羊血清封閉30 min后，分別滴加稀釋好的一抗CyclinD1(1∶40)、p16(1∶80)和p27(1∶50)(Santa Cruz公司)，以PBS作為陰性對照，于4℃孵育過夜。采用EnvisionPlus 二抗試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司)檢測細(xì)胞的免疫反應(yīng)性，操作步驟參照試劑盒說明書。DAB顯色后，經(jīng)蘇木精負(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片后光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) CyclinD1陽性著色位于細(xì)胞核內(nèi)，為棕黑色；p16在胞質(zhì)和胞核內(nèi)均有表達(dá)，主要位于胞核內(nèi)，為棕黃棕黑色；而p27陽性也是定位于細(xì)胞核內(nèi)，為棕褐色。評分標(biāo)準(zhǔn)參照Zutter等〔4〕的方法稍作改動，取任意5個高倍鏡視野(×400)下的核陽性細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)比例的平均值為陽性率。陽性率≤5%為陰性(-)，5%～25%為弱陽性(+)，26%～50%為陽性()，>50%為強(qiáng)陽性()。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0進(jìn)行χ2檢驗或Fisher確切概率法和Spearman等級相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞周期相關(guān)蛋白在胃腺癌中的表達(dá) 胃腺癌組和癌旁組CyclinD1、p16、p27陽性表達(dá)率差異顯著(P<0.01)。見表1和圖1。

表1 CyclinD1、p16和p27蛋白表達(dá)在胃腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)〔n(%),n=122〕

圖1 CyclinD1、p16和p27蛋白在胃腺癌組織中的陽性表達(dá)(EnvisionPlus，×400)

2.2CyclinD1、p16和p27蛋白的表達(dá)與患者臨床病理資料的關(guān)系 CyclinD1、p16和p27蛋白均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。CyclinD1和p16的陽性表達(dá)率在低分化與中高分化中有顯著差異(P<0.05)。p16蛋白表達(dá)的降低還與腫瘤的浸潤深度有關(guān)(P=0.037)。CyclinD1、p16和p27表達(dá)均與患者的性別、年齡、腫瘤大小和TNM分期等無明顯關(guān)系(表2)。

表2 Cyclin D1、p16和p27蛋白陽性表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系〔n(%)〕

2.3CyclinD1、p16和p27蛋白在胃腺癌組織中的相關(guān)關(guān)系 胃腺癌組織中CyclinD1的表達(dá)與p16蛋白呈負(fù)相關(guān)(r=-0.433，P<0.001)；CyclinD1與p27蛋白也呈負(fù)相關(guān)(r=-0.348，P<0.001)；但p27與p16蛋白之間無明顯的相關(guān)關(guān)系(r=0.152，P=0.094)。

3 討 論

CyclinD1蛋白作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白對細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期起重要調(diào)控作用，其過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔1,5,6〕。Feakins等〔7〕發(fā)現(xiàn)，CyclinD1蛋白陽性表達(dá)率在大腸癌與胃癌相似，約為55%，該結(jié)果也與本研究結(jié)果一致。研究表明，癌旁組織中CyclinD1蛋白表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)，癌旁組織中CyclinD1蛋白陽性是腫瘤術(shù)后局部復(fù)發(fā)的一個獨立預(yù)后指標(biāo)〔8〕。本研究結(jié)果提示CyclinD1蛋白的過表達(dá)與胃腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

p16蛋白能與CDK4和CDK6特異性結(jié)合形成二元復(fù)合體，抑制CDK4和CDK6活性，進(jìn)而抑制Rb蛋白磷酸化〔7〕。Tarakji等〔9〕對癌前多形性腺瘤組織中的p16蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，癌前多形性腺瘤組織中有81.4%的組織為p16陰性，僅有18.5%呈p16中等強(qiáng)度陽性，表明p16蛋白異常表達(dá)在癌前多形性腺瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。Motohashi等〔10〕對多種惡性腫瘤細(xì)胞系中的p16基因進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，p16基因在腫瘤中的突變率可達(dá)到30%～80%，可能是p16基因突變失活導(dǎo)致p16蛋白表達(dá)量降低或消失。研究表明，口咽部腫瘤患者癌組織中p16蛋白陰性的患者，其預(yù)后效果明顯差于p16陽性的患者〔11〕。本研究表明p16蛋白陰性與腫瘤進(jìn)展和分化密切相關(guān)，且預(yù)示預(yù)后不良。

p27蛋白和p16蛋白同是CDKs的抑制蛋白，對細(xì)胞的生長起負(fù)調(diào)控作用。p27蛋白異常表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后相關(guān)。對于眼瞼皮脂腺癌患者來說，p27陰性是預(yù)后不良的重要指標(biāo)〔12〕，而且其在乳腺癌和結(jié)直腸癌中的低表達(dá)與低存活率、腫瘤浸潤程度和高死亡率密切相關(guān)〔13,14〕。本研究顯示p27表達(dá)的消失與胃腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與胃腺癌進(jìn)展無直接關(guān)系。本研究說明當(dāng)p16蛋白和p27蛋白表達(dá)量減少時，CyclinD1蛋白表達(dá)量卻升高，使其能與CDK4結(jié)合更大程度地結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，進(jìn)而導(dǎo)致胃腺癌發(fā)生和發(fā)展。p16蛋白和p27蛋白與CyclinD1蛋白表達(dá)的負(fù)相關(guān)關(guān)系可能呈反饋調(diào)節(jié)關(guān)系，參與胃腺癌發(fā)生。綜上，CyclinD1和p16、p27對胃腺癌患者的預(yù)后評估均具有重要的意義，尤其是p16蛋白。

4 參考文獻(xiàn)

1陳小賀，孟文格，孟繁杰，等.大腸癌組織中CyclinD1和p16及Rb的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2006;13(1)：38-41.

2Michalides R.Prognosis for G1 cell-cycle regulators:useful for predicting course of disease and for assessment of therapy in cancer〔J〕.J Pathol,1999;188:341-3.

3Bar-Sela G,Hershkovitz D,Haim N,etal.The incidence and prognostic value of HER2 overexpression and cyclin D1 expression in patients with gastric or gastroesophageal junction adenocarcinoma in israel〔J〕.Oncol Lett,2013;5(2):559-63.

4Zutter MM,Mazoujian G,Santoro SA.Decreased expression of integrin adhesive protein receptors in adenocarcinoma of the breast〔J〕.Am J Pathol,1990;137(4):863-70.

5Biliran H Jr,Wang Y,Banerjee S，etal.Overexpression of cyclin D1 promotes tumor cell growth and confers resistance to cisplatin-mediated apoptosis in an elastase-myc transgene-expressing pancreatic tumor cell line〔J〕.Clin Cancer Res,2005;11(16):6075-86.

6趙美蓉，許一多.乳腺癌Cyclin D1、Rb蛋白表達(dá)的意義〔J〕，中國免疫學(xué)雜志，2006;22(4)：331-2.

7Feakins RM,Nickols CD,Bidd H,etal.Abnormal expression of pRb,p16,and Cyclin D1 in gastric adenocarcinoma and its lymph node metastases:relationship with pathological features and survival〔J〕.Hum Pathol,2003;34(12):1276-82.

8Gu J,Li K,Li M,etal.A role for p21-activated kinase 7 in the development of gastric cancer〔J〕. FEBS J,2013;280(1):46-55.

9Tarakji B,Altamimi MA,Baroudi K,etal.Immunohistochemical expression of p16 in carcinoma ex-pleomorphic adenoma(undifferentiated and adenocarcinoma types)〔J〕.J Clin Diagn Res,2013;7(12):3054-6.

10Motohashi M,Wakui S,Muto T,etal.Cyclin D1/cdk4, estrogen receptors α and β,in N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine-induced rat gastric carcinogenesis:immunohistochemical study〔J〕.J Toxicol Sci,2011;36(3):373-8.

11Shinohara S,Kikuchi M,Tona R,etal.Prognostic impact of p16 and p53 expression in oropharyngeal squamous cell carcinomas〔J〕.Jpn J Clin Oncol,2014;44(3):232-40.

12Kim N,Kim JE,Choung HK,etal.Expression of cell cycle regulatory proteins in eyelid sebaceous gland carcinoma:low p27 expression predicts poor prognosis〔J〕.Exp Eye Res,2014;118:46-52.

13Tan P,Cady B,Wanner P,etal.Pagano,the cell cycle inhibitor p27 is an independent prognostic marker in small(T1a,b) invasive breast carcinomas〔J〕.Cancer Res,1997;57：1259-63.

14Loda M,Cukor B,Tam SW,etal.Pagano,increased proteasome-dependent degradation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27 in aggressive colorectal carcinomas〔J〕.Nat Med，1997；3：231-4.