黃鳳珍 劉 軍 龐 棟 卜培莉

(濟(jì)南醫(yī)院內(nèi)一科，山東 濟(jì)南 250013)

代謝綜合征(MS)有多個(gè)易感基因，如脂聯(lián)素基因、漿細(xì)胞分化抗原-1基因、過(guò)氧化酶增殖物激活受體基因等。新近全基因組掃描在染色體3q27區(qū)繪制了一個(gè)MS的易感位點(diǎn)〔1〕，而編碼脂聯(lián)素(APN)的基因正位于此，提示APN基因可能是MS的一個(gè)相關(guān)基因。國(guó)外多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，APN基因以+45位點(diǎn)(外顯子2)T→G多態(tài)性和+276位點(diǎn)(內(nèi)含子2)G→T多態(tài)性相對(duì)常見(jiàn)，并證實(shí)SNP+45T/G、SNP+276G/T多態(tài)性與MS有關(guān)，而國(guó)內(nèi)APN基因多態(tài)性與MS和APN水平的相關(guān)性鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究探討了APN基因 SNP+45T/G和SNP+276G/T的基因型分布及其與MS和血漿APN水平的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 從本院2 025例老年人中選取年齡、性別匹配的漢族MS組448例，男328例，女120例，年齡65～87〔平均(75.42±3.58)〕歲；正常對(duì)照組(NC組)400例，男298例，女102例，年齡66～92〔平均(76.94±2.76)〕歲。MS診斷標(biāo)準(zhǔn)采用IDF(2005)標(biāo)準(zhǔn)，以中心性肥胖(腹圍)為診斷前提，肥胖診斷：腰圍(WC)>90 cm(男)、>80 cm(女)，同時(shí)具備以下四項(xiàng)指標(biāo)中任意兩項(xiàng)：①甘油三酯(TG)≥1.7 mmol/L或已接受治療；②高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)<0.9 mmol/L(40 mg/dl)(男)或<1.1 mmol/L (50 mg/dl)(女)，或已接受治療；③血壓：收縮壓(SBP)≥130 mmHg或舒張壓(DBP)≥85 mmHg，或已接受相應(yīng)治療或此前已診斷高血壓；④糖代謝異常：空腹血糖(FPG)≥5.6 mmol/L(100 mg/dl)或已接受相應(yīng)治療或此前已診斷2型糖尿病。NC組為不具備上述5項(xiàng)中的任何一項(xiàng)者。兩組均排除冠心病、肝腎功能異常、腫瘤等疾病。

1.2病史采集、體格檢查 對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，并測(cè)量身高、體重、WC、臀圍(HC)、血壓，抽取空腹靜脈血5 ml，其中3 ml用于測(cè)血糖、血脂、肝功、腎功，2 ml放入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝試管中,離心分離血漿和血液有形成分在-80℃冰箱保存，供測(cè)APN和提取DNA之用。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 ①外周血DNA提取：TIANamp Blood DNA Kit(TIANGEN公司) 提取DNA，DNA保存于-20℃冰箱備用。②聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增：SNP+276位點(diǎn)上游引物為：5′-CTCC TAC ACT GAT ATA AAC TAT ATG AAT-3′，下游引物為：5′-AATG TAC TGG GAA TAG GGA TGA-3′；SNP+45位點(diǎn)上游引物：5′-CTC CCT GTG TCT AGG CCT TAG-3′，下游引物：5′-TAG AAG TAG ACT CTG CTG AGA TG-3′，由博尚生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：總反應(yīng)體積25 μl,含DNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl,ddH2O 9.5 μl,在PCR儀上擴(kuò)增。PCR程序：SNP+276為預(yù)變性94℃ 5 min,循環(huán)：變性94℃ 45 s,退火54℃ 45 s，延伸72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸7 min，4℃保存。SNP+45為預(yù)變性94℃ 5 min，循環(huán)：變性94℃ 40 s,退火58℃ 40 s，延伸72℃ 45 s，共37個(gè)循環(huán)，再72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，溴乙啶染色，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)鑒定。③確定基因型 SNP+276：取6 μl PCR產(chǎn)物與1 μl EcoRⅠ(大連寶生物)、10×H buffer 2 μl、ddH2O 11 μl 37℃酶切過(guò)夜，2.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)鑒定基因型。SNP+45：取6 μl PCR產(chǎn)物與1 μl Sma I(大連寶生物)、10×T buffer 2 μl、0.1% BSA 2 μl、ddH2O 9 μl 30℃酶切4 h，2.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)鑒定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包。均數(shù)間比較用t檢驗(yàn)；直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各組等位基因和基因型頻率，組間基因型、等位基因頻率分布比較用pearsonχ2檢驗(yàn)；遺傳平衡吻合度χ2檢驗(yàn)群體基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2 結(jié) 果

2.1兩組體格檢查及血生化指標(biāo)比較 兩組比較體重指數(shù)(BMI)、SBP、DBP、WC、TG、HDL-C、FPG均有差異(P均=0.000)，見(jiàn)表1。

2.2APN基因SNP+276G/T的電泳分型 PCR擴(kuò)增結(jié)果為245 bp的片段，含T等位基因的片段存在EcoR Ⅰ的酶切位點(diǎn)。當(dāng)基因型為T(mén)T時(shí)，酶切產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)28 bp和217 bp兩條帶；基因型為GG時(shí)，只有245 bp一條帶；基因型為T(mén)G時(shí)，存在28 bp、217 bp和245 bp三條帶。28 bp片段太小，酶切后顯示不清。見(jiàn)圖1。

2.3APN基因SNP+45T/G的電泳分型 PCR擴(kuò)增結(jié)果為372 bp的片段，經(jīng)Sma Ⅰ酶切后產(chǎn)生三種基因型：野生型(T/T)，雜合子型(T/G)，純合子突變型(G/G)。含G等位基因的片段被酶切為209 bp和163 bp兩個(gè)片段。故若為純合G等位基因，被切為209 bp和163 bp兩個(gè)片段；為T(mén)、G雜合基因，酶切后有372 bp、209 bp和163 bp三個(gè)片段；為純合T等位基因，酶切后只有372 bp一個(gè)片段。見(jiàn)圖2。

圖1 APN基因SNP+276 G/T經(jīng)EcoR Ⅰ酶切圖譜

圖2 APN基因SNP+45 T/G經(jīng)Sma Ⅰ酶切圖譜

2.4Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 兩組分別進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)，P均>0.05，表示兩組樣本均來(lái)自遺傳平衡的總體，符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.5APN基因SNP+276G/T基因型與等位基因的分布 兩組在基因型分布上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。MS組T、G等位基因頻率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 兩組體格檢查及血生化指標(biāo)比較±s)

表2 兩組APN基因SNP+276 G/T基因型及等位基因頻率比較〔n(%)〕

2.6APN基因SNP+45T/G基因型與等位基因的分布 兩組在基因型分布上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P﹥0.05)。兩組T、G等位基因頻率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。見(jiàn)表3。

2.7兩組血漿APN水平比較 分別從MS組、NC組中隨機(jī)抽取174例進(jìn)行血漿APN水平測(cè)定，兩組年齡、性別匹配。MS組APN水平均值為(12.57±2.81) μg/ml,NC組為(13.55±1.50) μg/ml，MS組顯著低于NC組(P=0.008)。

2.8男性和女性血漿APN水平比較 整體人群中，男性血漿APN水平均值為(12.88±2.36) μg/ml，女性為(14.33±1.88) μg/ml；MS組中，男性為(12.10±2.93) μg/ml，女性為(13.87±1.72)μg/ml；NC組中，男性為(13.36±1.79) μg/ml，女性為(14.59±1.86) μg/ml，各組男性和女性APN水平比較，女性顯著高于男性(P均<0.05)。校正WC、WHR及HDL-C后，這種差異仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.9APN基因SNP+45T/G和SNP+276G/T與血漿APN水平之間的關(guān)系 SNP+45位點(diǎn)中，TT基因型的APN水平為(12.87±2.42) μg/ml，非TT型為(13.78±2.07) μg/ml，TT基因型顯著低于非TT基因型(P﹤0.05)；SNP+276位點(diǎn)中，GG基因型的APN水平為(13.24±2.30) μg/ml，非GG型為(13.38±2.32) μg/ml，兩者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表3 兩組APN基因+45 T/G基因型及

2.10MS危險(xiǎn)因素Logistic回歸模型 以MS作為因變量，SNP+45和SNP+276位點(diǎn)基因型、年齡、性別、血壓、FPG、BMI等作為自變量，進(jìn)行多因素逐步Logistic回歸分析，BMI、DBP、FPG、TG、+276位點(diǎn)基因型進(jìn)入回歸方程，表明SNP+276位點(diǎn)為MS發(fā)病的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表4 MS危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析

3 討 論

MS作為多重心血管危險(xiǎn)因素的聚集體，主要臨床表現(xiàn)有腹型肥胖、高血壓、血脂異常、高血糖等，它是引發(fā)心腦血管事件的高危因素，也是導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因〔2〕。MS的發(fā)病除了環(huán)境因素，遺傳因素在發(fā)病中的作用已得到證實(shí)。MS的患病率在不同人種之間差異顯著，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)，20歲以上美國(guó)人群的患病率華裔為14%～18%、歐洲裔為24%、阿拉伯和非洲裔為28%、墨西哥裔為38%〔3〕。因此，遺傳因素在MS發(fā)生發(fā)展中起重要作用，特別是與MS候選基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的相關(guān)研究是近幾年的研究熱點(diǎn)。胰島素抵抗(IR)是MS的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制，加之基因組掃描連鎖分析發(fā)現(xiàn)APN基因所在的人染色體3q27區(qū)與MS的多種表型密切相關(guān)〔1〕，提示APN基因可能與MS存在某種相關(guān)性。對(duì)5個(gè)不同人種的研究(日本人、德國(guó)人、法國(guó)人、美國(guó)人及瑞典高加索人)都顯示APN基因與IR和MS有關(guān)。但是該基因與IR和MS相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性在不同種族報(bào)道不一，提示在不同種族之間APN基因改變受遺傳背景和環(huán)境因素的共同作用影響。本研究結(jié)果顯示，SNP+276G/T與MS的發(fā)病相關(guān)，GG基因型個(gè)體發(fā)生MS的危險(xiǎn)性高于TT基因型；未發(fā)現(xiàn)SNP+45T/G與MS的發(fā)病相關(guān)。這與Yang等〔4～6〕報(bào)道不同，而與高加索人、突尼斯人〔7〕和韓國(guó)人〔8〕的研究相似。

自Scherer等〔9〕發(fā)現(xiàn)APN以來(lái)，對(duì)其認(rèn)識(shí)愈來(lái)愈深入，它具有改善胰島素敏感性，抗高血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化等效應(yīng)。大量臨床研究顯示血漿APN水平與血糖、TG及肥胖程度負(fù)相關(guān)，與胰島素敏感性和HDL-C正相關(guān)〔10～12〕。APN可能通過(guò)提高胰島素敏感性、改善糖脂代謝而對(duì)上述疾病起到保護(hù)作用。

Comuzzie等〔13〕報(bào)道血漿APN水平具有很強(qiáng)的遺傳傾向，通過(guò)基因組掃描發(fā)現(xiàn)了2個(gè)主要和4個(gè)可能的影響APN水平的區(qū)域，其中一個(gè)位于3號(hào)染色體。此后多個(gè)國(guó)外研究報(bào)道3號(hào)染色體APN基因變異與血漿APN水平有關(guān)。有研究報(bào)道SNP+45位點(diǎn)T和SNP+276位點(diǎn)G等位基因攜帶者血漿APN水平降低〔14，15〕。本研究還表明，血漿APN水平存在明顯的性別差異，女性高于男性，這與大量前期研究結(jié)果相符〔16〕。這種性別差異一方面與性激素有關(guān)，男性激素對(duì)APN基因表達(dá)有抑制作用〔17〕；另一方面可能與體脂分布和構(gòu)成的性別差異有關(guān)，并且已有研究表明女性脂肪組織APN表達(dá)明顯高于男性〔18〕。本研究顯示血漿APN水平與WC、腰臀比(WHR)負(fù)相關(guān)，而與HDL-C正相關(guān)。

本研究也進(jìn)一步探討了APN基因+45和+276位點(diǎn)基因多態(tài)性與血漿APN水平之間的關(guān)系：+45位點(diǎn)TT基因型個(gè)體血漿APN水平顯著低于非TT基因型個(gè)體，與上述報(bào)道相符；+276位點(diǎn)GG基因型個(gè)體血漿APN水平與非GG基因型個(gè)體相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與上述報(bào)道不符，這可能與種族和地區(qū)差異或測(cè)定血漿APN水平例數(shù)較少有關(guān)。

綜上，本研究證實(shí)APN基因+276G/T多態(tài)性與MS的發(fā)病有關(guān)，可能是漢族人群發(fā)生MS的一個(gè)候選基因。而+45T/G多態(tài)性與MS的發(fā)病可能無(wú)相關(guān)性。高APN水平可能是MS發(fā)病的一個(gè)保護(hù)性因素，檢測(cè)血漿APN有望成為預(yù)測(cè)MS發(fā)生的敏感指標(biāo)之一。

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