吳保祥 黃東 王昉

[摘要] 目的 建立N-（2-羥乙基）煙酰胺中有關(guān)物質(zhì)的測定方法。 方法 碳十八烷鍵合硅膠（5μm）填充4.0mm×25cm不銹鋼柱；流動相為水∶四氫呋喃∶三乙胺∶三氟乙酸（982∶10∶5∶3）；檢測波長：266nm；流速：1.0mL/min。結(jié)果 N-（2-羥乙基）煙酰胺與主要雜質(zhì)能得到有效分離，各雜質(zhì)在1.0～20μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。 結(jié)論 本測定方法靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，可以控制N-（2-羥乙基）煙酰胺中有關(guān)物質(zhì)的含量。

[關(guān)鍵詞] N-（2-羥乙基）煙酰胺；有關(guān)物質(zhì)；系統(tǒng)適用性

[中圖分類號] R927.2???[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B???[文章編號] 2095-0616（2014）11-92-03

Related substances determination of N-(2- hydroxyethyl) nicotinamide by HPLC

WU?Baoxiang1??HUANG?Dong1??WANG?Fang2

1.Jiangsu Tasly Diyi Pharmaceutical CO., Ltd, Huaian 223002,China;2.Analytical＆Testing Center of Nanjing Normal University, Nanjing 210046,China

[Abstract] Objective To establish an HPLC method for detection of N-(2-hydroxyethyl) nicotinamide related substances. Methods The analytical column was C18 column (4.0mm×25cm, 5μm); The mobile phase was water: THF∶triethylamine∶trifluoroacetic acid = 982∶10∶5∶3; The wavelength was 254nm; The flow rate was 1.0 mL/min. Results A satisfactory separation condition for the five related impurities, the impurities standard curve was good linear in the range of 1.0-20μg/mL .Conclusion The method is sensitive and accurate and it can be used to determine the relateted substances of nicorandil.

[Key words] N-(2-hydroxyethyl) nicotinamide; Related substances; System suitability

N-（2-羥乙基）煙酰胺為類白色或淺米黃色結(jié)晶或粉末，味甘，易溶于水，易吸濕。是生產(chǎn)尼可地爾重要的中間體，其質(zhì)量的優(yōu)劣直接決定尼可地爾成品的質(zhì)量。尼可地爾（nicorandil），又名硝煙酯，化學(xué)名為N-（α-羥乙基）煙酰胺硝酸酯，是日本在1976年研制的煙酸類衍生物。它是一種鉀通道激活劑，可以舒張動脈血管，同時又具有硝酸酯基結(jié)構(gòu)，可以舒張靜脈血管。目前，尼可地爾作為一種新型藥物，在臨床上廣泛用于心絞痛、高血壓等疾病的治療，增加冠脈血流量，不影響血壓、心率及傳導(dǎo)，用于治療心絞痛，與硝酸酯一樣，煙浪丁可激活細(xì)胞質(zhì)鳥苷酸環(huán)化酶，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷升高和細(xì)胞內(nèi)鈣的降低，同時引起血管平滑肌松弛。N-（2-羥乙基）煙酰胺原標(biāo)準(zhǔn)中只檢查熔點(diǎn)，干燥失重等項(xiàng)目，不能全面控制產(chǎn)品的質(zhì)量。本研究采用高效液相色譜法來測定N-（2-羥乙基）煙酰胺中的有關(guān)物質(zhì)，按照ICH指南Q2A、Q2B，及

美國藥典和歐洲藥典的規(guī)定，需要對該方法進(jìn)行驗(yàn)證，以評價方法能否滿足N-（2-羥乙基）煙酰胺有關(guān)物質(zhì)測定的準(zhǔn)確性、可靠性和靈敏度要求。參考文獻(xiàn)[1-7]方法，本研究采用高效液相色譜法建立了N-（2-羥乙基）煙酰胺中有關(guān)物質(zhì)的分析方法，并對該方法的專屬性、精密度、線性、回收率、檢測限和定量限等進(jìn)行了驗(yàn)證，方法可行。

1?儀器設(shè)備與試劑試藥

HPLC高效液相色譜儀系統(tǒng)：沃特斯高效液相色譜儀2489檢測器，2695分離單元（四元泵、717自動進(jìn)樣器、柱溫箱）；軟件：Empower3 工作站，HP1008打印機(jī)。

尼可地爾工作標(biāo)準(zhǔn)品（20100701）；四氫呋喃（色譜純200808066，美國天地公司）；三乙胺（色譜純08071，美國默克公司）；三氟乙酸（色譜純09012，美國默克公司），N-（2-羥乙基）煙酰胺工作對照品（lot：20100601，含量：99.0%中間體）；煙酸（lot：1309101，含量：99.5%），煙酸乙酯（lot：NK1307001a，含量：99.2%）。

圖1??分離度色譜圖

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件

色譜柱：C18（5μm）25cm×4.0mm。流速為1.0mL/min；檢測波長為266nm。流動相∶水∶四氫呋喃∶三乙胺∶三氟乙酸（982∶10∶5∶3）；進(jìn)樣量：10μL。

2.2?溶液制備

取20mg N-（2-羥乙基）煙酰胺用流動相溶解并稀釋至10.0mL容量瓶中作為樣品溶液。取10μL樣品溶液注入液相色譜儀，系統(tǒng)適應(yīng)性：靈敏度測試準(zhǔn)確量取1.0mL樣品溶液，加入流動相制成50.0mL作為系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。吸取1.0mL系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，加入流動相準(zhǔn)確制成20mL作為儀器靈敏度測試液，各取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，在靈敏度測試圖譜中，煙酸乙酯峰面積約為系統(tǒng)適應(yīng)性測試圖譜中N-（2-羥乙基）煙酰胺峰面積的2%~8%。

2.3?系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)系統(tǒng)測試

取10mg煙酸、煙酸乙酯用流動相制成10mL，吸取1mL加入10mL樣品溶液，按上述條件進(jìn)行測試，煙酸與N-（2-羥乙基）煙酰胺分離度應(yīng)不小于2.0，系統(tǒng)重復(fù)性試驗(yàn)：取10μL系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，按上述條件測試連續(xù)進(jìn)樣6次。記錄色譜圖，按峰面積計算，N-（2-羥乙基）煙酰胺峰面積相對平均偏差不超過2.0%?？瞻诇y試：取稀釋溶劑10μL進(jìn)樣，作為溶劑空白，考察溶劑對雜質(zhì)測定有無干擾，樣品測定中溶劑空白產(chǎn)生的峰應(yīng)忽略。

2.4?方法的專屬性

2.4.1?雜質(zhì)及N-（2-羥乙基）煙酰胺的分子結(jié)構(gòu)確認(rèn)（委托南京師范大學(xué)分析中心檢測）?通過紫外分光光度計、液相色譜-質(zhì)譜、紅外分光光度計等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析確證各雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)[2]。

2.4.2?單個雜質(zhì)的定性?分別取N-（2-羥乙基）煙酰胺（lot：NK131002b，含量：99.0%中間體）10mg至一個50.0mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，混合均勻。進(jìn)樣，記錄N-（2-羥乙基）煙酰胺的保留時間，用保留時間對N-（2-羥乙基）煙酰胺進(jìn)行定性。煙酸乙酯（lot：NK1307001a，含量：99.2%）10mg至一個25.0mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，混合均勻。進(jìn)樣，記錄煙酸乙酯的保留時間，用保留時間對煙酸乙酯進(jìn)行定性。煙酸（lot：1309101，含量：99.5%）10mg至一個50.0mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，混合均勻。進(jìn)樣，記錄煙酸的保留時間，用保留時間對煙酸進(jìn)行定性。在分別取以上三種溶液5mL至同一個50mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣，記錄色譜圖，計算各組分的分離度，各雜質(zhì)的分離度和理論板數(shù)都符合規(guī)定。

2.5?強(qiáng)制降解試驗(yàn)

分別精密稱取N-（2-羥乙基）煙酰胺樣品細(xì)粉20mg分別置于20mL容量瓶中，共5份，分別在強(qiáng)酸1、2、3、5h、強(qiáng)堿1、2、3、5h、強(qiáng)氧化1、2、3、5h高溫、光照1、3、5、10d等條件進(jìn)行強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)，用溶劑稀釋至刻度，即得1.0mg/mL的溶液，以上樣品分別用液相色譜儀進(jìn)樣測定，由色譜圖可看出各破壞條件下的降解產(chǎn)物與N-（2-羥乙基）煙酰胺主成分峰均有良好的分離[3]。

2.6?精密度和重復(fù)性

在重復(fù)性測試項(xiàng)下，取標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)重復(fù)6次進(jìn)樣，按峰面積計算，各組分峰面積的RSD均小于2.0%；在中間精密度測試項(xiàng)下，另一人取標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)重復(fù)6次進(jìn)樣，按峰面積計算，各組分峰面積的RSD均小于2.0%；不同人員之間，峰面積的RSD均小于2.0%。表明重復(fù)性和中間精密度兩者之間的沒有顯著性差異。重復(fù)性和中間精密度均符合規(guī)定。

2.7?N-（2-羥乙基）煙酰胺及其雜質(zhì)的線性關(guān)系考察

各組分標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別精密稱取以下標(biāo)準(zhǔn)品：N-（2-羥乙基）煙酰胺（lot：NK131002b，含量：99.0%中間體），煙酸乙酯（lot：NK1307001a，含量：99.2%），煙酸（lot：1309101，含量：99.5%）10.0mg，分別到一個50mL容量瓶中，加入稀釋溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，混合均勻，即得。每個組分的濃度均約為200.0μg/mL。

精密量取各組分對照品的貯備液0.5，1，2，4，6，8，10mL分別至7個100mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，制成濃度分別為1、2、4、8、12、16、20μg/mL的一系列溶液，搖勻，各精密量取10μL，注入液相色譜儀。記錄各濃度的色譜峰面積，以峰面積A對濃度C（μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得N-（2-羥乙基）煙酰胺的有關(guān)物質(zhì)的回歸方程分別為：煙酸A=56291.3C-136.1，r=0.9995；煙酸乙酯A=40428.1C+296.01，r=0.9990。結(jié)果表明有關(guān)物質(zhì)煙酸及有關(guān)物質(zhì)煙酸乙酯在1～20μg/mL的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.8?加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密稱取已測定有關(guān)物質(zhì)含量的樣品適量，共3份，分別置100mL棕色容量瓶中，加適量溶劑溶解，然后各精密加入有關(guān)物質(zhì)對照品的貯備液1.6mL，2.0mL和2.4mL，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“樣品有關(guān)物質(zhì)測定”項(xiàng)下的方法分別測定有關(guān)物質(zhì)的含量，減去樣品本底，計算回收率，結(jié)果測得的平均回收率分別為：煙酸為99.5%，RSD=0.93%（n=9）；煙酸乙酯為99.0%，RSD=1.3，（n=9）；N-（2-羥乙基）煙酰胺為98.6%，RSD=1.1%（n=9）。

2.9?雜質(zhì)檢測限、定量限的測定

在選定的色譜條件下，按信噪比為3對最低檢測限進(jìn)行測定，結(jié)果表明：煙酸的濃度為4.30×10-3μg/mL，進(jìn)樣量為10μL時，最低檢測限量為0.3ng。煙酸乙酯濃度為6.52×10-3μg/mL，進(jìn)樣量為10μL時，最低檢測限量為0.6ng。按信噪比為10對最低定量限進(jìn)行測定，結(jié)果表明煙酸的濃度為2.51×10-2μg/mL，進(jìn)樣量為10μL時，最低定量限量為0.5ng。煙酸乙酯的濃度為5.25×10-2μg/mL，進(jìn)樣量為10μL時，最低定量限量為0.8ng。其他未知雜質(zhì)的檢測限和定量限以N-（2-羥乙基）煙酰胺來進(jìn)行評價，依次為0.05ng和0.01ng。

2.10?樣品的穩(wěn)定性

取N-（2-羥乙基）煙酰胺0.10mg·mL樣品溶液存放在冷處分別于0、3、5、10、20h和50h進(jìn)樣測定。記錄色譜圖，按面積歸一化法計算樣品溶液中的雜質(zhì)。結(jié)果有關(guān)物質(zhì)含量與初始溶液相比無明顯變化，RSD為1.0%，而且沒有降解產(chǎn)物出現(xiàn)，結(jié)果表明，樣品放置2~8℃下，2d穩(wěn)定性良好。

2.11?樣品有關(guān)物質(zhì)測定（表1）

表1??樣品中有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果（%）

名稱 批號

NK1305001b NK1305002b NK1305003b

煙酸 0.02 0.01 0.02

煙酸乙酯 0.01 0.02 0.01

單個最大未知雜質(zhì) 0.02 0.01 0.02

總雜質(zhì) 0.08 0.06 0.07

取樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖至主成分保留時間的2.5倍。按面積歸一化法計算單一雜質(zhì)及總雜質(zhì)的含量，N-（2-羥乙基）煙酰胺樣品雜質(zhì)含量測定結(jié)果符合歐洲藥典European pharmacopoeia7.0規(guī)定[7]。

3?討論

取N-（2-羥乙基）煙酰胺工作標(biāo)準(zhǔn)品、煙酸工作對照品、煙酸乙酯用溶劑溶解稀釋制成溶液，在200~400nm波長掃描，N-（2-羥乙基）煙酰胺在266nm處有最大吸收峰，煙酸在262nm處有最大吸收峰；煙酸乙酯在273nm處有最大吸收峰，在266nm處兩個雜質(zhì)均有較大吸收峰，所以選擇254nm作為本品有關(guān)物質(zhì)的檢測波長[8-9]。

實(shí)驗(yàn)時曾試用日常檢驗(yàn)常用的色譜柱AngilentODS C18柱及Diamonsil C18柱進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者的煙酸乙酯峰的拖尾因子為2.10，后者的煙酸乙酯峰拖尾1.1，分離度也較好，可獲得滿意的結(jié)果，說明本法對色譜柱有一定的選擇性[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜HPLC法檢查N-（2-羥乙基）煙酰胺有關(guān)物質(zhì)[12]，能較好的分離N-（2-羥乙基）煙酰胺中主成分、各中間體和分解產(chǎn)物，方法簡便，專屬性良好。方法可用于藥物穩(wěn)定性考察和N-（2-羥乙基）煙酰胺產(chǎn)品的放行[13-14]。

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（收稿日期：2014-04-02）