蘇標+徐慶微+黃志力+張國祥

[摘要] 目的 探討丁酸鈉對乳腺癌細胞MCF-7生長的抑制作用。 方法 將乳腺癌細胞MCF-7常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，采用濃度為0、2.5、5.0、10.0mmol/L的丁酸鈉處理后，觀察對MCF生長的抑制作用。結(jié)果 濃度為2.5、5.0、10.0mmol/L的丁酸鈉處理的MCF-7細胞生長速度明顯慢于親本細胞，隨著濃度的增加呈減慢趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。濃度為5mmol/L的丁酸鈉處理后的MCF-7細胞克隆形成率明顯低于MCF親本細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。丁酸鈉處理的細胞G1明顯高于親本細胞，S期及G2/M期明顯低于親本細胞，凋亡細胞百分比明顯高于親本細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 丁酸鈉可能是通過誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡而起到逆轉(zhuǎn)其惡性生物學(xué)行為的作用。

[關(guān)鍵詞] 丁酸鈉；乳腺癌細胞；MCF-7；抑制

[中圖分類號] R737.9???[文獻標識碼] A???[文章編號] 2095-0616（2014）11-33-04

The inhibitory effect of sodium butyrate on MCF-7 breast cancer cells growth

SU?Biao??XU?Qingwei??HUANG?Zhili??ZHANG?Guoxiang

Department of General Surgery, Guangzhou City Liwan District People's Hospital, Guangzhou 510000, China

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of sodium butyrate on the growth of breast cancer cells MCF-7. Methods Breast cancer MCF-7 cells were cultured to logarithmic growth phase, they were processed with sodium butyrate, 0, 2.5, 5.0, 10.0mmol/L were the concentration, the growth inhibition of MCF was observed. Results The growth rate of MCF-7 cell processed with the sodium butyrate with the Concentration 2.5, 5.0, 10.0mmol/L was significantly slower than that of the parent cell, the growth rate with increasing concentration was slower, there was the significant difference(P＜0.05). The colony efficiency of MCF-7 cells processed with the sodium butyrate with the concentration 5mmol/L was significantly lower than that of the parental cells, there was the significant difference (P＜0.05). After processed with sodium butyrate, Cell G1 was significantly higher than the parental cells, S phase and G2 / M phase were significantly lower than the parental cells, the percentage of apoptotic cells was significantly higher than the parental cells, there was the significant difference(P＜0.05). Conclusion Sodium butyrate may be by inducing apoptosis in MCF-7 cells and play a reversal of its role in the m alignant behavior.

[Key words] Butyrate; Breast cancer cells; MCF-7; Suppression

乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，嚴重影響女性的健康，近年來在世界范圍內(nèi)乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢并且年齡逐漸年輕化[1-2]。丁酸鈉為短鏈脂肪酸丁酸的鈉鹽，主要通過改變組蛋白的乙酰化程度來改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，參與多種基因的表達[3]。部分食物在人體沒有經(jīng)過小腸消化，厭氧菌對上述食物中的碳水化合物及蛋白分解發(fā)酵后即可產(chǎn)生丁酸鈉，其在結(jié)腸上皮細胞的能量來源中占有較大比例，使結(jié)腸肽或生長因子的釋放受到刺激，對結(jié)腸黏膜血供進行調(diào)節(jié)，促進上皮細胞的增殖[4]，但有報道表明，丁酸鈉還具有抑制腫瘤細胞增殖及誘導(dǎo)細胞衰老與凋亡等作用[5-8]。筆者為了探討乳腺癌

細胞MCF-7生長是否會受到丁酸鈉的抑制，將乳腺癌細胞MCF-7采用丁酸鈉處理后對其細胞生長速度、倍增時間等進行觀察，現(xiàn)報道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

本研究時間段為2013年5~12月。乳腺癌細胞MCF-7提供單位：中科院上海細胞庫；丁酸鈉提供單位：美國Sigma公司，CAS號：156-54-7，采用高壓滅菌的蒸餾水溶解，配成0、2.5、5.0、10.0mmol/L濃度，分裝后放置于-20℃凍存；胎牛血清提供單位：杭州四季青生物工程材料研究所；胰蛋白酶、EDTA等提供單位：德國Merk公司；蛋白酶K、DNA分子量Markers等提供單位：美國Invitrogen公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析級。

1.2?研究方法

1.2.1?生長速度和倍增時間的檢測?常規(guī)消化對數(shù)生長期的MCF-7細胞，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔接種1×104個細胞，共接種72孔，在溫度為37℃、5%CO2孵箱中孵育24h。處理細胞的丁酸鈉的濃度分別為0、2.5、5.0、10.0mmol/L。每組藥物濃度均設(shè)3個復(fù)孔，各濃度計數(shù)3孔細胞/d，采用Microsoft Excel軟件計算各濃度各時間的平均值及標準差。做細胞生長的柱形圖，將培養(yǎng)時間（d）及細胞數(shù)分別作為柱形圖的橫縱坐標，按照以下公式計算倍增時間：TD（倍增時間）=t（Nt與N0間隔時間）*log2/[logNt（培養(yǎng)后的細胞數(shù)）-logN0（起始時間細胞數(shù)）]。

1.2.2?平板克隆形成率?取對數(shù)生長期的MCF-7親本細胞接種于6個平皿，每平皿接種1×102個細胞，在溫度為37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h，將其中3個平皿的細胞用濃度為5.0mmol/L的丁酸鈉處理24h，同時設(shè)對照組，即剩余的3個平皿不采用丁酸鈉處理，在相同條件下培養(yǎng)21d，固定使用甲醛溶液，Gimesa染色。將平均克隆數(shù)計算出來并根據(jù)平均克隆數(shù)及接種細胞數(shù)得出克隆形成率（為平均克隆數(shù)與接種細胞數(shù)的比值與100%的乘積）。

endprint

1.2.3?細胞周期及凋亡的測定?取對數(shù)生長期MCF-7親本細胞常規(guī)消化，接種于6個培養(yǎng)瓶，每瓶接種5×105個細胞，在37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)24h后，將其中的3瓶細胞采用濃度為5.0mmol/L的丁酸鈉進行處理，同時設(shè)對照組，即為剩余的3瓶細胞，在相同條件下培養(yǎng)24h后收集不同處理組的細胞。在4℃的條件下細胞采用濃度為70%的乙醇固定過夜。用預(yù)冷的PBS在染色前洗3次。將200μL濃度為1mg/mL的 RNase A加入，在37℃條件下溫育30min。將800μL濃度為100ng/mL的碘化丙錠（PI）染色液混勻后加入，在避光4℃條件下放置30min。DNA的含量采用流式細胞儀（CouIter-profilo II型）測定，細胞周期分布及細胞凋亡情況采用Multicycle DNA含量及細胞周期分析軟件分析。

1.3?觀察指標

（1）MCF-7細胞生長速度，倍增時間；（2）克隆形成率；（3）細胞周期：G1、S期、G2/M期；（4）凋亡細胞百分比。

1.4?統(tǒng)計學(xué)處理

將研究所得數(shù)據(jù)輸入計算機，建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，符合正態(tài)分布的計量資料采用（）表示，采用F檢驗對多組間差異進行比較，采用t檢驗對兩組間差異進行比較，采用x2檢驗對計數(shù)資料組間差異進行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?對MCF-7細胞生長速度及倍增時間的影響

2.1.1?對MCF-7細胞生長速度的影響?濃度為2.5、5.0、10.0mmol/L的丁酸鈉處理的MCF-7細胞生長速度明顯慢于親本細胞，隨著濃度的增加呈減慢趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.15，P＜0.05）。見圖1。

圖1??丁酸鈉對MCF-7細胞生長的抑制作用

2.1.2?各種濃度丁酸鈉對MCF-7倍增時間的影響?MCF-7親本細胞的倍增時間為（30.1±2.6）h、2.5mmol/L丁酸鈉處理的MCF-7倍增時間為（65.8±4.7）h、5mmol/L丁酸鈉處理的MCF-7倍增時間為（171.6±9.5）h、10mmol/L丁酸鈉處理的MCF-7倍增時間為（304.2±13.1）h。各種濃度丁酸鈉處理的MCF-7倍增時間均明顯高于MCF-7親本細胞的倍增時間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.86，P＜0.05），并且倍增時間隨著丁酸鈉濃度的升高也呈現(xiàn)升高趨勢。

2.2?對MCF-7細胞克隆形成率的影響

MCF-7親本細胞平均形成（69.5±10.4）個細胞克隆，平均細胞克隆形成率為69.5%，而濃度為5mmol/L的丁酸鈉處理后的MCF-7細胞平均形成（17.8±3.2）個細胞克隆，平均細胞克隆形成率為17.8%，濃度為5mmol/L的丁酸鈉處理后的MCF-7細胞克隆形成率明顯低于MCF親本細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=9.37，P＜0.05）。

2.3?對MCF-7細胞細胞周期的影響

丁酸鈉處理的MCF-7細胞G1明顯高于親本細胞，S期及G2/M期明顯低于親本細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.4?對MCF-7細胞凋亡的影響

丁酸鈉處理的凋亡細胞百分比明顯高于親本細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1??對MCF-7細胞細胞周期的影響（）

組別 G1 S期 G2/M期

親本細胞 52.6±1.3 37.9±0.4 10.3±0.9

處理后的MCF-7細胞 81.3±0.7 13.2±0.2 5.4±0.6

t 6.07 3.71 4.58

P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表2??對MCF-7細胞凋亡的影響

組別 總細胞數(shù) 凋亡細胞數(shù) 凋亡細胞百分比（%）

親本細胞 10 798 18 0.17

丁酸鈉處理的細胞 9352 1816 19.42

x2 11.38

P ＜0.05

3?討論

腫瘤治療方法的療效通常取決于兩個關(guān)鍵因素，即治療靶點的有效性和對腫瘤細胞的選擇性[9]。現(xiàn)行腫瘤化療、放療以細胞的核苷酸、蛋白代謝或DNA為治療作用靶點，沒有選擇性，難以避免毒副作用強，宿主與腫瘤之間治療窗小的缺點。為此，針對新的分子靶點設(shè)計高效、低毒的腫瘤治療新方法，已成為目前腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)展的主導(dǎo)趨勢[10-12]。尋找腫瘤細胞特異性分子靶點是本領(lǐng)域目前待解決的關(guān)鍵難題。體外培養(yǎng)的惡性腫瘤細胞生長速度較快，倍增時間較短及無限的體外傳代能力是其典型的惡性生物學(xué)特征，所以，減慢細胞的生長速度及延長倍增時間等策略對體外培養(yǎng)的惡性腫瘤細胞來講是效果較好的腫瘤治療方法[13-14]。

本次研究表明，濃度為2.5、5.0、10.0mmol/L的丁酸鈉處理的MCF-7細胞生長速度明顯慢于親本細胞，隨著濃度的增加呈減慢趨勢，濃度為5mmol/L的丁酸鈉處理后的MCF-7細胞克隆形成率明顯低于MCF親本細胞，丁酸鈉處理的細胞G1明顯高于親本細胞，S期及G2/M期明顯低于親本細胞，丁酸鈉處理的凋亡細胞百分比明顯高于親本細胞，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。謝瑞蓮等[7]觀察組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c對人乳腺癌細胞株MCF-7細胞增殖的影響，結(jié)果表明，采用不同濃度丁酸鈉處理乳腺癌MCF-7細胞后均有顯著的抑制增殖作用，并且作用時間越長、所用丁酸鈉劑量越大則抑制MCF-7細胞作用越明顯，細胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)變化，該研究結(jié)果與本次研究結(jié)果具有一致性。MCF-7細胞為人乳腺癌細胞株，生長增殖旺盛，由研究結(jié)果可見，其一，乳腺癌細胞MCF-7采用丁酸鈉處理后能夠抑制其生長。計算克隆形成率以便更好的了解細胞的群體依賴性及增殖能力，根據(jù)腫瘤細胞中惡性程度不同，惡性程度較高的與惡性程度低的比較明顯較強[15-16]；其二，采用丁酸鈉處理乳腺癌細胞MCF-7后降低了平均細胞克隆率，使其增殖能力受到抑制。丁酸鈉是一種組蛋白去乙?；敢种苿拱┘毎阴；钠胶鉅顟B(tài)被打破，癌細胞發(fā)生凋亡。其三，采用丁酸鈉處理后明顯影響了MCF-7細胞的細胞周期分布，G1期細胞升高，S期細胞降低，提示采用丁酸鈉處理后抑制了細胞的DNA合成，將其阻滯在G1期，使惡性增殖受到抑制。反應(yīng)惡性腫瘤惡性生物學(xué)活性的各項指標中生長速度、倍增時間、克隆形成率及細胞周期分布變化等具有重要的意義[13，17-18]。細胞凋亡會影響個體的發(fā)育及某些疾病的發(fā)生發(fā)展，腫瘤是一種凋亡受阻性疾病，所以，在腫瘤的治療方面阻滯細胞的增殖周期，使其增長受到抑制，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡增加為一個抗癌藥物研究的重要方向。其四，丁酸鈉處理乳腺癌細胞MCF-7能使其惡性生物學(xué)行為受到抑制。總之，丁酸鈉可能是通過誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡而起到逆轉(zhuǎn)其惡性生物學(xué)行為的作用。

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（收稿日期：2014-04-14）

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（收稿日期：2014-04-14）

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