石茂玲，鄧 波，劉 蒙，徐安凱，王志峰，周 可，周冀瓊

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院草地研究所，北京 100193；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧分院草地研究所，吉林 長(zhǎng)春 136100)

紫花苜蓿(Medicagosativa)為多年生豆科牧草，是世界上種植廣泛的優(yōu)質(zhì)牧草，在我國(guó)已有2000年的栽培歷史[1]，素有“牧草之王”的美稱(chēng)。

根瘤菌是一類(lèi)廣泛分布于土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌[2]。根瘤菌能侵染豆科植物根部或莖部形成根瘤或莖瘤，并在根瘤或莖瘤中分化成類(lèi)菌體，將空氣中的氮素固定為植物可吸收利用的氮[3,4]。根瘤菌與豆科植物形成的共生固氮體系具有非常顯著的特點(diǎn)，要使苜蓿獲得最佳固氮效果，需要根瘤菌與寄主植物間的交互作用匹配很好[5]，而且根瘤菌-豆科植物共生關(guān)系和地理環(huán)境存在密切關(guān)系[6-8]。

吉林省是我國(guó)紫花苜蓿的重要生產(chǎn)基地，試驗(yàn)以栽培面積較大的“公農(nóng)1號(hào)”紫花苜蓿為研究對(duì)象，對(duì)4個(gè)生態(tài)類(lèi)型地區(qū)的紫花苜蓿根瘤菌資源進(jìn)行調(diào)查，分離純化不同生態(tài)類(lèi)型地區(qū)的具有優(yōu)良性能的“公農(nóng)1號(hào)”苜蓿根瘤菌株，以期為該地區(qū)菌劑研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 根瘤菌資源調(diào)查

試驗(yàn)選取吉林省4個(gè)不同生態(tài)類(lèi)型地區(qū)，即西部沙地草原區(qū)(白城市)、中部草甸草原區(qū)(大安市)、中部平原農(nóng)田區(qū)(公主嶺市)、東部山地農(nóng)田區(qū)(延吉市)為調(diào)查樣區(qū)。于2011年5月采樣，詳細(xì)記錄樣地周?chē)h(huán)境，土壤類(lèi)型，植物生長(zhǎng)狀態(tài)(營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、花期等)以及根瘤形態(tài)。每個(gè)樣區(qū)選3個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)3次重復(fù)。采集按照邊長(zhǎng)為30 cm的正方形挖掘植株，記錄根瘤數(shù)、有效根瘤數(shù)(粉紅色或淺紅色根瘤)、根瘤著生部位，量取根瘤大小，稱(chēng)量單個(gè)根瘤重及總根瘤重。

1.2 根瘤菌株的分離、純化

將根瘤用無(wú)菌水沖洗干凈，0.1%的HgCl2溶液浸泡5 min，95%乙醇處理30～60 s，無(wú)菌水沖凈,接種于YMA 斜面,挑取單菌落,革蘭氏染色鏡檢,直至得到純菌落。

1.3 水培回接試驗(yàn)

回接試驗(yàn)是確定根瘤分離物是否為根瘤菌的方法，在根部結(jié)瘤的可以初步確定為根瘤菌[9,10]。將“公農(nóng)1號(hào)”苜蓿種子消毒催芽后,浸泡于相應(yīng)的根瘤菌株懸液30 min，移入低氮培養(yǎng)基試管，剩余菌液加入微氮培養(yǎng)基試管，加蓋棉塞，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～10 d，去掉棉塞，自然培養(yǎng)。每個(gè)試管3粒種子，每菌株4個(gè)試管作為重復(fù)。同時(shí)以不接種根瘤菌株的苜蓿苗為對(duì)照，適時(shí)加入無(wú)菌水。植物生長(zhǎng)45 d進(jìn)行收獲，觀(guān)察植株生長(zhǎng)并記錄。

1.4 盆栽試驗(yàn)

1.4.1 土壤處理 試驗(yàn)在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院溫室進(jìn)行，土壤類(lèi)型為暗棕色沙壤土，中性至微酸性。將土壤壓碎去雜，充分混勻，稱(chēng)取5 kg，121 ℃高溫滅菌后于25 cm花盆種植。

1.4.2 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將“公農(nóng)1號(hào)”苜蓿種子消毒催芽后，用菌液浸泡15 min均勻播種于花盆，播種深度為1.5～2.0 cm，每個(gè)花盆栽植10株，并將剩余菌液澆于種苗周?chē)?，同時(shí)以不接菌者為空白對(duì)照。采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)。最后轉(zhuǎn)入光強(qiáng)7 000 lx、溫度為( 22±3) ℃、日照時(shí)數(shù)12 h的溫室中培養(yǎng)，并根據(jù)花盆中失水狀況定期澆水。

1.4.3 接種效果的觀(guān)測(cè) 植物生長(zhǎng)到61 d開(kāi)始觀(guān)測(cè)，收獲時(shí)將根沖洗干凈,分別測(cè)定每株植物的莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根瘤數(shù)和植物干重等。

(1)莖長(zhǎng)和根長(zhǎng) 將植株完全挖出土壤，用水沖洗根系，在新鮮狀態(tài)下用直尺分別測(cè)定主莖和主根的長(zhǎng)度。

(2)單株根瘤數(shù) 挖掘植株，輕抖根系的土壤，保證根瘤的完整，用水仔細(xì)沖洗后計(jì)算單株根瘤數(shù)。

(3)單株干重 將植株在烘箱中120 ℃殺青40 min，70 ℃烘干48 h，稱(chēng)重。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理 用EXCEL 2007軟件、SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌資源調(diào)查

吉林省“公農(nóng)1號(hào)”紫花苜蓿根瘤菌的調(diào)查共采集了公主嶺農(nóng)田、白城沙地和草地、大安草甸草地、延吉山地農(nóng)田的74株苜蓿，4種生態(tài)類(lèi)型區(qū)的土壤中苜蓿根瘤多分布于根部10 cm以下的須根上；種植年限較長(zhǎng)的苜蓿，根瘤多分布于表層須根；根瘤顏色以紅色、粉紅色或褐紅色居多，形狀大多為橢圓形、指狀、掌狀，部分不規(guī)則。

不同生態(tài)類(lèi)型地區(qū)、不同土壤類(lèi)型及不同建植年限“公農(nóng)1號(hào)”苜蓿的根瘤數(shù)和根瘤重均存在差異(表1)。2010年種植于白城地區(qū)鹽堿土的根瘤重顯著大于沙壤土(P<0.05)，但鹽堿地苜蓿根瘤數(shù)與沙壤土根瘤數(shù)間差異不顯著；沙壤土中根瘤重相差不顯著的情況下，2003年種植的苜蓿的根瘤數(shù)明顯比2008、2010年的根瘤數(shù)多。大安地區(qū)草原草甸土中，2003和2010年苜蓿的根瘤數(shù)相差不多，但2003年苜蓿的根瘤重顯著大于2010年苜蓿的根瘤重(P<0.05)。于1997年種植于延吉地區(qū)的苜蓿，山地暗棕壤的根瘤數(shù)和根瘤重顯著多于農(nóng)田灰棕壤，農(nóng)田灰棕壤顯著多于山溝暗棕壤(P<0.05)。公主嶺沙壤土1989年種植的苜蓿的根瘤重顯著大于其他年份苜蓿的根瘤重，但根瘤數(shù)最少；2006年苜蓿的根瘤數(shù)顯著高于其他年份苜蓿的根瘤數(shù)(P<0.05)，同時(shí)其根瘤重較大。

表1 不同生態(tài)類(lèi)型地區(qū)根瘤分布，根瘤數(shù)和根瘤重

注：同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 根瘤菌分離、純化與回接

從采集的根瘤中，通過(guò)分離獲得純培養(yǎng)物81株，均為快生菌。分離純化的菌株在回接試驗(yàn)中，有8個(gè)菌株能使“公農(nóng)1號(hào)”苜蓿結(jié)瘤。綜合結(jié)瘤數(shù)、生物量、根瘤重等指標(biāo)，通過(guò)對(duì)菌株的顯微形態(tài)、生理生化的研究，初步確定這8菌株為根瘤菌株，并用于盆栽篩選試驗(yàn)(表2)。

表2 篩選出的根瘤菌株編號(hào)及來(lái)源

2.3 接種根瘤菌株對(duì)苜蓿生長(zhǎng)和結(jié)瘤的影響

經(jīng)過(guò)75 d溫室盆栽試驗(yàn)，所得根瘤大多數(shù)是橢圓形、指狀，極少數(shù)為掌狀(表3)。

2.3.1 根瘤菌株對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的影響 通過(guò)分析了接種根瘤菌株的“公農(nóng)1號(hào)”苜蓿的莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、葉片數(shù)、干重和根瘤數(shù)數(shù)據(jù)，可以看出，根瘤菌株對(duì)苜蓿的莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、葉片數(shù)、干重和根瘤數(shù)均有明顯影響，在8個(gè)供試菌株中，對(duì)莖長(zhǎng)影響較顯著的菌株依次是yj34、bc94、gzl59、yj30、bc18和bc8，分別使莖長(zhǎng)增加60.17%、59.86%、52.38%、51.83%、45.60%和39.75%，bc10和da80與其他菌株間差異顯著(P<0.05)。8菌株均對(duì)植株根長(zhǎng)有顯著影響，使根長(zhǎng)增加29.68%～64.32%，其中，接種gzl59的效果最好，比對(duì)照增加64.32%；供試菌對(duì)植株葉片數(shù)的影響也很顯著，菌株bc94、yj34、yj30、gzl59和bc18的葉片數(shù)顯著高于其他菌株(P<0.05)；供試苜蓿接種根瘤菌株gzl59、bc94、bc18、yj30和yj34能顯著增加其單株干重(P<0.05)，其中接種gzl59效果最好，比對(duì)照增長(zhǎng)約3倍。

2.3.2 根瘤菌株對(duì)紫花苜蓿結(jié)瘤的影響 單株根瘤數(shù)不僅包括已具有固氮能力的根瘤和暫時(shí)還不具有固氮能力的根瘤，同時(shí)還包括沒(méi)有固氮能力的無(wú)效瘤?！肮r(nóng)1號(hào)”接種的所有根瘤菌株與對(duì)照差異顯著(P<0.05)，根瘤數(shù)比對(duì)照增加32%～104%。菌株bc8、bc10、bc18、yj30、yj34及菌株gzl59的結(jié)瘤效果較好，其中菌株yj34根瘤數(shù)最多(P<0.05)。

表3 接種不同根瘤菌株后苜蓿莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、葉片數(shù)、干重和根瘤數(shù)

3 討論與結(jié)論

(1)植物本身的遺傳特性以及外界生境的不同會(huì)使根瘤的生成及其在宿主植物上的著生部位、顏色、形狀等基本形態(tài)特征存在一定差異[11,12]。生長(zhǎng)在不同生境的紫花苜蓿，根瘤分布情況不同，這與趙龍飛[13]，徐琳等[14]的研究結(jié)果類(lèi)似。

研究報(bào)道，土著菌數(shù)量的多少與土壤肥力、水分、當(dāng)?shù)貧夂驐l件等有關(guān)。楊旭升等[15]研究表明，種植苜蓿對(duì)土壤中苜蓿根瘤菌數(shù)量的明顯增加具有時(shí)間的累加效應(yīng)。種植3年乃至多年的草甸土或鹽堿土苜蓿根瘤菌的含量明顯多于僅種植1年的草地土壤。且不同的土壤中土著菌的生存和定殖能力不同。土著菌的數(shù)量多少還與土壤的質(zhì)地有關(guān)，與質(zhì)地較差的土壤相比，質(zhì)地較好的土壤可以為根瘤菌提供更多的保護(hù)，因此，根瘤菌的數(shù)量也較多[16,17]。此外，復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境可能比單一的生態(tài)環(huán)境更利于根瘤菌的生存和結(jié)瘤。

結(jié)果表明，吉林省域內(nèi)同一地區(qū)同一土壤類(lèi)型的苜蓿種植時(shí)間越長(zhǎng)，其根瘤重量越大；同年種植的苜蓿，鹽堿土的根瘤重大于沙壤土，山地暗棕壤的根瘤數(shù)多于農(nóng)田灰棕壤。說(shuō)明不同生態(tài)類(lèi)型地區(qū)、不同土壤類(lèi)型及不同建植年限的根瘤數(shù)量、重量存在差異。根瘤形成和發(fā)育與生態(tài)類(lèi)型、土壤環(huán)境和建植年限存在著密切相關(guān)。此次試驗(yàn)與其他研究者的研究結(jié)果一致，可為吉林省根瘤菌資源研究及其開(kāi)發(fā)利用提供相關(guān)科學(xué)資料。

(2)諸多研究發(fā)現(xiàn)，生態(tài)條件、土壤類(lèi)型及起源等都會(huì)影響豆科植物與根瘤菌共生作用及其有效性[18,19]。師尚禮等[20]在2001年做的苜蓿根瘤菌有效性及影響因子的研究也表明，土壤結(jié)構(gòu)、類(lèi)型等會(huì)對(duì)土壤中根瘤菌的數(shù)目及其有效性產(chǎn)生影響。寧國(guó)贊等[21]、戴小密等[22]研究發(fā)現(xiàn)，根瘤菌接種在各地區(qū)增產(chǎn)幅度差異較大。黃芳等[23]也發(fā)現(xiàn)，同一豆科植物與根瘤菌組合在不同土壤中的產(chǎn)量差異顯著。王晶等[24]在黑土和草甸土上接種根瘤菌株，發(fā)現(xiàn)由于中性或微堿性環(huán)境適于根瘤菌生長(zhǎng)，根瘤菌在黑土上的接種效果極顯著高于草甸土。

采用“公農(nóng)1號(hào)”苜蓿回接結(jié)瘤試驗(yàn)，從分離純化的81株根瘤分離物中獲得匹配性較好的8個(gè)菌株。再經(jīng)篩選，獲得促進(jìn)植株生長(zhǎng)、結(jié)瘤能力均較強(qiáng)的根瘤菌株bc94，gzl59和yj34，確定為“公農(nóng)1號(hào)”苜蓿吉林省區(qū)域內(nèi)的高效根瘤菌株。3個(gè)高效菌株接種苜蓿的生長(zhǎng)效應(yīng)優(yōu)于其他菌株，說(shuō)明來(lái)源于沙壤土、暗棕壤和山溝生態(tài)類(lèi)型地區(qū)“公農(nóng)1號(hào)”苜蓿的根瘤菌株表現(xiàn)優(yōu)于來(lái)源于其他土壤類(lèi)型或生態(tài)類(lèi)型地區(qū)根瘤菌株，對(duì)苜蓿植株具有促進(jìn)作用。同時(shí)說(shuō)明了根瘤菌對(duì)生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)性。

(3)土壤盆栽試驗(yàn)，對(duì)照處理(無(wú)接種)的苜蓿也出 現(xiàn)了結(jié)瘤現(xiàn)象，說(shuō)明“公農(nóng)1號(hào)”苜蓿種子中有內(nèi)生的根瘤菌存在。雖然其存在有助于苜蓿結(jié)瘤固氮和植株生長(zhǎng)，但從試驗(yàn)各處理的結(jié)果和對(duì)照的顯著性分析來(lái)看，在結(jié)瘤競(jìng)爭(zhēng)能力方面，種子內(nèi)的根瘤菌遠(yuǎn)不如所接種的根瘤菌。這與陳力玉等[25]的研究結(jié)果一致。

參考文獻(xiàn):

[1] 周敏.中國(guó)苜蓿栽培史初探[J].草原與草坪,2004(1)：44-46.

[2] 史曉霞,師尚禮,楊晶,等.豆科植物根瘤菌分類(lèi)研究進(jìn)展[J].草原與草坪,2006(1)：12-17.

[3] 陳文新,汪恩濤.中國(guó)根瘤菌[M].北京：科學(xué)出版社,2011：3-4.

[4] 張虎天，郭麗琢，柴強(qiáng)，等.接種根瘤菌對(duì)豌豆/玉米體系根際細(xì)菌數(shù)量及氮營(yíng)養(yǎng)的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，45(2)：30-33.

[5] 馬其東,劉自學(xué),洪紱曾,等.不同根系發(fā)育能力的苜蓿品種接種根瘤菌的效果[J].草業(yè)學(xué)報(bào),1999,8(4)：36-45.

[6] 陳文新,汪恩濤.根瘤菌-豆科植物共生多樣性與地理環(huán)境的關(guān)系[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2004,37(1)：81-86.

[7] 劉曉云,郭振國(guó),李喬仙,等.南苜蓿高效共生根瘤菌土壤的篩選[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2011,31(14)：4034-4041.

[8] 曾昭海,隋新華,胡躍高,等.紫花苜蓿-根瘤菌高效共生體篩選及其田間作用效果研究[C]∥第二屆中國(guó)苜蓿大會(huì)論文集，北京：中國(guó)草學(xué)會(huì),2003：68-70.

[9] 肖文麗.大豆根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤機(jī)理及其主要影響因子的初步研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2010.

[10] 蔣攀.四川大豆根瘤菌高效菌株的初步篩選[D].四川：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[11] 陳衛(wèi)民,張執(zhí)欣,張宏昌,等.甘肅中西部豆科植物根瘤菌多樣性調(diào)查研究[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2006,24(1)：183-186.

[12] 楊文權(quán),郭軍康,馮春生,等.寧夏豆科植物根瘤菌資源調(diào)查及其生態(tài)分布[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2007,25(5)：176-181.

[13] 趙龍飛.河南商丘地區(qū)豆科植物根瘤菌資源多樣性調(diào)查[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(5)：329-331.

[14] 徐琳,劉賢德,張勇,等.祁連山部分地區(qū)豆科植物根瘤菌資源調(diào)查[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2012,30(4)：236-240.

[15] 楊旭升,馬志軍,郭春景.北方寒地草場(chǎng)土壤中苜蓿根瘤菌分布狀況研究[J].黑龍江科學(xué),2012,2(6)：10-11.

[16] 曾昭海,陳丹明,胡躍高,等.不同生態(tài)區(qū)若干典型作物土壤中紫花苜蓿土著根瘤菌分布狀況[J].草業(yè)科學(xué),2003,20(10)：26-28.

[17] 王海霞,王永華,蘭劍,等.寧夏紫花苜蓿土著根瘤茵的分布狀況研究[J].寧夏農(nóng)林科技,2012,53(01)：44-46.

[18] 江木蘭,張學(xué)江,徐巧珍,等.大豆-根瘤菌的固氮作用[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2003,25(1)：50-53.

[19] 何慶元,胡艷,玉永雄.生態(tài)環(huán)境對(duì)根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤影響的研究進(jìn)展[J].大豆科學(xué),2004,23(1)：66-70.

[20] 師尚禮,曹致中,趙桂琴,等.苜蓿根瘤菌有效性及其影響因子分析[J].草地學(xué)報(bào),2007,15(3)：221-226.

[21] 寧國(guó)贊,劉惠琴.中國(guó)豆科牧草根瘤菌大面積應(yīng)用13年回顧[J].中國(guó)草地,1995(4)：56-59.

[22] 戴小密,劉彥杰,葉小梅,等.接種大豆根瘤菌遺傳工程菌株LMG101對(duì)大豆的增產(chǎn)效應(yīng)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,36(1)：66-70.

[23] 黃芳,許修宏.不同類(lèi)型土壤中大豆與根瘤菌的匹配性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,38(2)：211-214.

[24] 王晶,許修宏.根瘤菌與大豆在不同類(lèi)型土壤中的生態(tài)適應(yīng)性研究[J].中國(guó)土壤與肥料,2009(5)：72-76.

[25] 陳力玉,張淑卿,李劍峰,等.接種熒光標(biāo)記根瘤菌對(duì)苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響[J].草原與草坪,2013,33(6):1-8.