隋永恒 連 敏 華 靜

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所(200001)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種與內(nèi)臟型肥胖、胰島素抵抗以及遺傳易感因素密切相關(guān)的臨床病理綜合征，其發(fā) 病率逐年上升，已成為我國(guó)繼慢性乙型肝炎之后 的主要肝病類型[1-2]。炎癥-免疫系統(tǒng)活化是NAFLD發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。炎性小體是一種由細(xì)胞感染或應(yīng)激激活的蛋白復(fù)合體，通過(guò)激活caspase-1介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-1β成熟，啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答[3]。目前發(fā)現(xiàn)的炎性小體主要包括NLRP1、NLRP3、IPAF和AIM2，相關(guān)研究主要集中于對(duì)NLRP3炎性小體的探索，其能被分子、細(xì)菌或病毒激活，在諸多疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，炎性小體在多種肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制中居重要地位[4]。本研究以高脂飲食建立NAFLD小鼠模型，并在體外以不同種類脂肪酸處理原代肝細(xì)胞，探討體內(nèi)外高脂處理對(duì)肝臟NLRP3炎性小體相關(guān)基因NLRP3、caspase-1、IL-1β表達(dá)的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

健康雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。D-Hanks液、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Ⅰ型和Ⅳ型膠原酶、臺(tái)盼藍(lán)染料、棕櫚酸(palmitic acid, PA)、油酸(oleic acid, OA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)、脂多糖(LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；鼠尾膠原蛋白Ⅰ型購(gòu)自上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司；油紅O染料購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；PCR引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；兔抗鼠NLRP3多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔抗鼠GAPDH單克隆抗體、HRP偶聯(lián)羊抗兔IgG購(gòu)自上?？党缮锕こ逃邢薰?；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

二、方法

1. 分組和模型建立：30只6～8周齡C57BL/6J小鼠(體質(zhì)量19～20 g)隨機(jī)分為高脂飲食組(n=20)和對(duì)照組(n=10)，高脂飲食組給予高脂飲食(熱量來(lái)源：脂肪59%，碳水化合物25%，蛋白質(zhì)16%)，對(duì)照組給予正常飲食(熱量來(lái)源：脂肪12%，碳水化合物59%，蛋白質(zhì)29%)。喂飼16周后處死小鼠，取肝組織液氮冷凍或4%甲醛溶液固定待測(cè)。

2. 肝組織病理學(xué)檢查：取肝組織標(biāo)本，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)表現(xiàn)。

3. 肝細(xì)胞分離培養(yǎng)：8周齡正常飲食C57BL/6J小鼠以4%水合氯醛麻醉，分離門靜脈，24G留置針穿刺插管固定，以D-Hanks液灌注，至肝臟呈土黃色后改為灌注含0.025%Ⅰ型膠原酶和0.05% Ⅳ型膠原酶的DMEM溶液20 min。分離肝臟，剪碎肝組織，置于含膠原酶的DMEM溶液中消化10 min，以100目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，獲得細(xì)胞懸液，離心(500×g,7 min)后PBS清洗2次。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活率>85%，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL，接種于鋪有鼠尾膠原蛋白Ⅰ型的培養(yǎng)皿，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，洗去未貼壁細(xì)胞。

4. 體外游離脂肪酸處理原代肝細(xì)胞：原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)6 h后換液，以含不同種類脂肪酸(PA 0.25 mmol/L，OA 0.25 mmol/L，DHA 0.05 mmol/L)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，對(duì)照組原代肝細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)6、20、24 h。另取原代肝細(xì)胞，以含LPS 1000 ng/mL的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。洗去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞待測(cè)。

5. 肝細(xì)胞油紅O染色：取經(jīng)脂肪酸(PA、OA、DHA)處理20 h的肝細(xì)胞和相同培養(yǎng)時(shí)間的對(duì)照組肝細(xì)胞，4%甲醛溶液固定30 min，油紅O避光染色30 min，60%異丙醇沖洗2 s，蒸餾水清洗30 s，蘇木素染色25 s，明膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。

6. Real-time PCR法：取肝組織、經(jīng)脂肪酸(PA、OA、DHA)處理6 h的肝細(xì)胞以及相同培養(yǎng)時(shí)間的對(duì)照組肝細(xì)胞，以Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行real-time PCR檢測(cè)。NLRP3引物上游：5’-GAG TTC TTC GCT GCT ATG T-3’，下游：5’-ACC TTC ACG TCT CGG TTC-3’；caspase-1引物上游：5’-TGG AGA GAA ACA AGG AG-3’，下游：5’-TTG AAG AGC AGA AAG CAA T-3’；IL-1β引物上游：5’-TCT TTG AAG TTG ACG GAC CC-3’，下游：5’-TGA GTG ATA CTG CCT GCC TG-3’；β-actin引物上游：5’-TGT TAC CAA CTG GGA CGA CA-3’，下游：5’-CTG GGT CAT CTT TTC ACG GT-3’。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。以2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

7. 蛋白質(zhì)印跡法：取經(jīng)脂肪酸(PA、OA、DHA)、LPS處理24 h的肝細(xì)胞以及相同培養(yǎng)時(shí)間的對(duì)照組肝細(xì)胞，以細(xì)胞裂解液抽提細(xì)胞總蛋白，取蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，濕法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入兔抗鼠NLRP3多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗鼠GAPDH單克隆抗體(1∶5 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，室溫復(fù)溫30 min，TBS清洗，加入HRP偶聯(lián)羊抗兔IgG(1∶10 000)，室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光劑顯色，置暗盒X線曝光，常規(guī)顯影、定影。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、高脂飲食對(duì)小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)的影響

高脂飲食組小鼠肝組織內(nèi)可見(jiàn)大量空泡樣脂肪變性，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；對(duì)照組小鼠肝組織未見(jiàn)明顯異常(見(jiàn)圖1)。

二、體外高脂處理對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響

油紅O染色結(jié)果顯示，對(duì)照組肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量脂質(zhì)沉積，PA組肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量脂質(zhì)沉積，OA和DHA組肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)中等量脂質(zhì)沉積(見(jiàn)圖2)。

三、高脂飲食對(duì)肝組織NLRP3炎性小體相關(guān)基因表達(dá)的影響

Real-time PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高脂飲食組小鼠肝組織內(nèi)NLRP3、caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)顯著增高(P<0.05)(見(jiàn)圖3)。

A：對(duì)照組；B：高脂飲食組

A：對(duì)照組；B：PA組；C：OA組；D：DHA組

*與對(duì)照組比較，P<0.05

四、脂肪酸對(duì)肝細(xì)胞NLRP3炎性小體相關(guān)基因表達(dá)的影響

Real-time PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，PA組肝細(xì)胞NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而DHA組NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，OA組兩者表達(dá)與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三組caspase-1 mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖4)。

*與對(duì)照組比較，P<0.05

五、脂肪酸對(duì)肝細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，PA、OA組NLRP3蛋白表達(dá)較LPS組升高，DHA組NLRP3蛋白表達(dá)較LPS組降低(見(jiàn)圖5)。

圖5 脂肪酸對(duì)肝細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)的影響

討 論

肝臟是體內(nèi)脂質(zhì)代謝的主要場(chǎng)所，肝內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度或異常沉積是引起NAFLD的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥相關(guān)信號(hào)途徑活化是NAFLD發(fā)展至非酒精性 脂肪性肝炎(NASH)的重要因素[5]。近年研究[6-7]顯示，炎性小體基因缺失小鼠由高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟損傷、胰島素抵抗延緩，炎性小體介導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子活化在NAFLD發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受到重視。

本研究以高脂飲食喂飼小鼠16周建立NAFLD模型，發(fā)現(xiàn)小鼠肝組織存在顯著脂肪變性，肝組織中NLRP3炎性小體相關(guān)基因NLRP3、caspase-1、IL-1β mRNA 表達(dá)較正常飲食小鼠明顯增高。Csak等[8]的研究卻發(fā)現(xiàn)，以高脂飲食喂飼小鼠4周后，其肝組織中NLRP3炎性小體相關(guān)基因表達(dá)與正常飲食小鼠相比無(wú)明顯差異。本課題組既往研究[9]發(fā)現(xiàn)，短期(4～6周)高脂飲食喂飼小鼠并不引起肝細(xì)胞內(nèi)明顯脂質(zhì)沉積，喂飼8～12周后，肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)顯著脂肪變性。由此可見(jiàn)，肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積是炎性小體表達(dá)增加的前提。研究指出，NLRP3炎性小體既可由病原體相關(guān)分子模式激活，也可由危險(xiǎn)相關(guān)分子模式激活[3,10]。細(xì)胞內(nèi)脂肪酸過(guò)度沉積被認(rèn)為是內(nèi)源性危險(xiǎn)相關(guān)分子模式，可啟動(dòng)炎癥反應(yīng)[11]。由此推測(cè)，脂肪酸水平升高、肝內(nèi)顯著脂肪變性可能啟動(dòng)了內(nèi)源性危險(xiǎn)相關(guān)分子模式介導(dǎo)的NLRP3炎性小體相關(guān)基因表達(dá)。

游離脂肪酸作為NAFLD發(fā)展中一個(gè)早期且至關(guān)重要的因素，在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠和遺傳性肥胖個(gè)體中均明顯升高。脂肪酸水平升高和肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度沉積是NAFLD的特征性表現(xiàn)。本研究通過(guò)體外不同種類脂肪酸處理模擬體內(nèi)高脂環(huán)境，觀察脂肪酸對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積和炎性小體表達(dá)的影響。油紅O染色結(jié)果顯示，不同種類脂肪酸中以飽和脂肪酸PA誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的效應(yīng)最為顯著。同時(shí)real-time PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)PA處理的肝細(xì)胞，NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著升高，而經(jīng)多不飽和脂肪酸DHA處理的肝細(xì)胞，NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著降低。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，PA處理可致肝細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)增加，DHA處理則降低NLRP3蛋白表達(dá)。提示不同種類的脂肪酸對(duì)炎性小體具有不同影響，飽和脂肪酸引起肝內(nèi)NLRP3炎性小體表達(dá)增加，活化相關(guān)炎癥反應(yīng)，而多不飽和脂肪酸則具有相反的效應(yīng)。DHA是一種ω-3多不飽和脂肪酸，在抗炎和免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)控作用。本課題組既往研究[12]證實(shí)，喂飼富含飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸飲食可引起小鼠肝臟顯著脂肪變性以及炎癥-免疫系統(tǒng)活化，而喂飼富含多不飽和脂肪酸飲食則無(wú)上述影響。體外細(xì)胞學(xué)研究[13]證實(shí)，高濃度ω-3多不飽和脂肪酸可顯著降低LPS誘導(dǎo)的單核細(xì)胞NF-κB活化，減少腫瘤壞死因子(TNF)-α產(chǎn)生。Schm?cker等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，肝組織中內(nèi)源性ω-3多不飽和脂肪酸含量增加可降低肝內(nèi)多種炎性因子的表達(dá)，從而緩解D-氨基半乳糖/LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷。上述研究提示，多不飽和脂肪酸具有抗炎作用，可降低NLRP3炎性小體表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)可能是其保護(hù)肝細(xì)胞的重要機(jī)制之一。

NLRP3炎性小體的活化機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為，炎性小體活化需兩種信號(hào)介導(dǎo)，一種信號(hào)誘導(dǎo)炎性小體成分基因表達(dá)上調(diào)，另一種信號(hào)促進(jìn)炎性小體成分裝配以及功能活化。LPS聯(lián)合脂肪酸可誘導(dǎo)肝臟Kupffer細(xì)胞激活炎性小體，而脂肪酸單獨(dú)作用于Kupffer細(xì)胞并不引起炎性小體活化[15]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)以飽和脂肪酸PA處理肝細(xì)胞亦可引起NLRP3基因和蛋白表達(dá)升高，推測(cè)在肝細(xì)胞中飽和脂肪酸可作為Toll樣受體(TLRs)的配體介導(dǎo)炎性小體表達(dá)，而脂肪酸損傷的肝細(xì)胞釋放的內(nèi)源性物質(zhì)可作為另一種配體活化炎性小體。

綜上所述，肝內(nèi)脂質(zhì)尤其是飽和脂肪酸沉積可引起NLRP3炎性小體相關(guān)基因表達(dá)升高，促進(jìn)肝臟局部炎癥反應(yīng)和NAFLD進(jìn)展，而多不飽和脂肪酸可降低NLRP3炎性小體相關(guān)基因表達(dá)，可能具有抗炎、保護(hù)肝細(xì)胞的作用，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1 Fan JG, Farrell GC. Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease in China[J]. J Hepatol, 2009, 50 (1): 204-210.

2 Vuppalanchi R, Chalasani N. Nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis: Selected practical issues in their evaluation and management[J]. Hepatology, 2009, 49 (1): 306-317.

3 Schroder K, Tschopp J. The inflammasomes[J]. Cell, 2010, 140 (6): 821-832.

4 Szabo G, Csak T. Inflammasomes in liver diseases[J]. J Hepatol, 2012, 57 (3): 642-654.

5 Lalor PF, Faint J, Aarbodem Y, et al. The role of cytokines and chemokines in the development of steatohepatitis[J]. Semin Liver Dis, 2007, 27 (2): 173-193.

6 Vandanmagsar B, Youm YH, Ravussin A, et al. The NLRP3 inflammasome instigates obesity-induced inflammation and insulin resistance[J]. Nat Med, 2011, 17 (2): 179-188.

7 Stienstra R, van Diepen JA, Tack CJ, et al. Inflammasome is a central player in the induction of obesity and insulin resistance[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108 (37): 15324-15329.

8 Csak T, Ganz M, Pespisa J, et al. Fatty acid and endotoxin activate inflammasomes in mouse hepatocytes that release danger signals to stimulate immune cells[J]. Hepatology, 2011, 54 (1): 133-144.

9 Ma X, Hua J, Li Z. Probiotics improve high fat diet-induced hepatic steatosis and insulin resistance by increasing hepatic NKT cells[J]. J Hepatol, 2008, 49 (5): 821-830.

10 Bauernfeind F, Ablasser A, Bartok E, et al. Inflamma-somes: current understanding and open questions[J]. Cell Mol Life Sci, 2011, 68 (5): 765-783.

11 Shi H, Kokoeva MV, Inouye K, et al. TLR4 links innate immunity and fatty acid-induced insulin resistance[J]. J Clin Invest, 2006, 116 (11): 3015-3025.

12 Hua J, Ma X, Webb T, et al. Dietary fatty acids modulate antigen presentation to hepatic NKT cells in nonalcoholic fatty liver disease[J]. J Lipid Res, 2010, 51 (7): 1696-1703.

13 Novak TE, Babcock TA, Jho DH, et al. NF-kappa B inhibition by omega -3 fatty acids modulates LPS-stimulated macrophage TNF-alpha transcription[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2003, 284 (1): L84-L89.

14 Schm?cker C, Weylandt KH, Kahlke L, et al. ω-3 fatty acids alleviate chemically induced acute hepatitis by suppression of cytokines[J]. Hepatology, 2007, 45 (4): 864-869.

15 Miura K, Yang L, van Rooijen N, et al. Toll-like receptor 2 and palmitic acid cooperatively contribute to the development of nonalcoholic steatohepatitis through inflammasome activation in mice[J]. Hepatology, 2013, 57 (2): 577-589.