張 峰 諸葛宇征 顧建祥 李昱江

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化內(nèi)科(210008)

肝纖維化是各種慢性肝病所致的一種創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，其特點(diǎn)是肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積[1]。HSCs的活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，因此抑制HSCs活化表型是肝纖維化治療的重要策略。S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)是機(jī)體最重要的甲基供體，亦是臨床上常用的保肝退黃藥物，近年研究表明SAM具有一定的抗纖維化作用[2]，SAM能抑制HSCs的增殖，并可通過(guò)抑制HSCs的某些信號(hào)通路而阻止其活化[3-4]，但目前尚不能完全闡釋SAM對(duì)活化HSCs的影響及其抗纖維化機(jī)制。本研究通過(guò)探討SAM對(duì)活化人肝星狀細(xì)胞株LX-2細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡以及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth muscle actin, SMA)的影響，以期為進(jìn)一步研究SAM的抗纖維化作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、細(xì)胞株、主要試劑

人肝星狀細(xì)胞株LX-2購(gòu)于博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司，為人HSCs轉(zhuǎn)染SV40后經(jīng)低濃度血清篩選得到的細(xì)胞株。

SAM購(gòu)自雅培中國(guó)，應(yīng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配制成濃度為10 mmol/L的母液，以0.22 μm微孔濾器過(guò)濾，調(diào)節(jié)pH值至7.4，4 ℃保存?zhèn)溆茫４鏁r(shí)間不超過(guò)6 h。DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白定量試劑購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；PI/RNase染色緩沖液、ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、Trizol試劑購(gòu)自日本Takara公司；鼠抗人α-SMA抗體、山羊抗鼠IgG、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：LX-2細(xì)胞株采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2. CCK-8實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞濃度約5×104/mL，常規(guī)培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁良好，棄上清，改用含不同濃度SAM(0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mmol/L)的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后輕輕吸去上清液，含胎牛血清培養(yǎng)基100 μL/孔漂洗1次，加入已混勻的含CCK-8的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基與CCK-8體積之比為9∶1)100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，上酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm處的吸光度(A)值。6個(gè)復(fù)孔的結(jié)果去掉最大和最小A值，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。抑制率(%)=(A對(duì)照組-A藥物組)/A對(duì)照組×100%，并繪制增殖抑制曲線。

3. 流式細(xì)胞術(shù)：①細(xì)胞周期：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入含不同濃度SAM(0、1.0、2.0、4.0 mmol/L)的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h。采用不含EDTA的胰酶消化，收集約1×106個(gè)細(xì)胞，離心棄上清，PBS漂洗1次；加入-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇重懸，4 ℃固定至少24 h；離心棄固定液；PBS漂洗2次，加500 μL PI/RNase緩沖液重懸，室溫避光15 min，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期。②細(xì)胞凋亡：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入含不同濃度SAM(0、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L)的培養(yǎng)基，胰酶消化、收集1×105～5×105個(gè)細(xì)胞；加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞；先后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻；室溫避光反應(yīng)5～15 min；上機(jī)檢測(cè)。

4. 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1) mRNA表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入含不同濃度SAM(0、1.0、2.0、4.0 mmol/L)培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h。采用Trizol試劑提取LX-2細(xì)胞總RNA并合成cDNA模板。PCR引物由日本Takara公司設(shè)計(jì)合成，cyclin D1上游：5’-ATG TTC GTG GCC TCT AAG ATG A-3’，下游：5’-CAG GTT CCA CTT GAG CTT GTT C-3’；以GAPDH為內(nèi)參，上游：5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’，下游：5’-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3’。使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒行PCR，以2-△△Ct法計(jì)算目的基因的表達(dá)，上ABI 7500 Biosystem行結(jié)果分析。

5. 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入含不同濃度SAM(0、1.0、2.0、4.0 mmol/L)的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h。采用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，BCA法蛋白量，行常規(guī)SDS-PAGE電泳。5%脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)印膜。加入抗α-SMA單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體(1∶2 500)室溫孵育1 h，最后ECL發(fā)光液顯影。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、SAM抑制LX-2細(xì)胞增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著SAM濃度增加，LX-2細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高；與對(duì)照組相比，3.0～8.0 mmol/L SAM組細(xì)胞增殖抑制率明顯升高(P<0.05)，而1.0、2.0 mmol/L組無(wú)明顯差異(P>0.05)(見(jiàn)圖1)。說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)，SAM能抑制LX-2細(xì)胞的增殖，并呈劑量依賴效應(yīng)。

圖1 SAM對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響

二、SAM阻滯LX-2細(xì)胞周期于S期

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，隨著SAM濃度的增加，G1/G0期細(xì)胞比例逐漸下降(F=20.149，P<0.001)，S期細(xì)胞比例逐漸升高(F=17.979，P=0.001)，G2/M期細(xì)胞比例無(wú)明確變化趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，1.0 mmol/L組G1/G0、S、G2/M期細(xì)胞比例均無(wú)明顯差異(P>0.05)；2.0、4.0 mmol/L組G1/G0期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)，S期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例無(wú)明顯差異(見(jiàn)表1)。說(shuō)明SAM可使LX-2細(xì)胞周期阻滯于S期。

表1 各組細(xì)胞周期分布情況

*與對(duì)照組比較，P<0.05

三、SAM誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，SAM能誘導(dǎo)LX-2 細(xì)胞凋亡，并呈劑量依賴效應(yīng)。與對(duì)照組相比，1.0、2.0 mmol/L組的細(xì)胞早期、晚期和總體凋亡率均無(wú)明顯差異(P>0.05)；4.0、8.0 mmol/L組的早期凋亡率顯著升高(27.3%、36.8%對(duì)7.0%，P<0.05)，總體凋亡率亦顯著升高(33.3%、44.5%對(duì)9.9%，P<0.05)，而晚期凋亡率無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖2)。

四、SAM 增強(qiáng)cyclin D1 mRNA表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR法結(jié)果顯示，不同濃度SAM組cyclin D1 mRNA表達(dá)較對(duì)照組呈逐漸增高的趨勢(shì)，其中2.0、4.0 mmol/L組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

五、SAM降低α-SMA蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，1.0、2.0、4.0 mmol/L SMA組細(xì)胞內(nèi)纖維化標(biāo)記物α-SMA蛋白表達(dá)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(見(jiàn)表2、圖3)。

*與對(duì)照組比較，P<0.05

表2 各組cyclin D1 mRNA表達(dá)和α-SMA蛋白表達(dá)情況

*與對(duì)照組比較，P<0.05

1 Da=0.9921 u

討 論

靜息HSCs轉(zhuǎn)化為活化HSCs表型是肝纖維化發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，而活化HSCs轉(zhuǎn)化為靜息HSCs表型是肝纖維化逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵。因此，抑制甚至逆轉(zhuǎn)活化HSCs是肝纖維化的潛在治療策略。目前，抑制HSCs活化和抗纖維化的藥物層出不窮，但絕大多數(shù)仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，尚缺乏能廣泛用于臨床且療效顯著的藥物[5]。

SAM為一種臨床應(yīng)用多年的保肝降黃藥物。近年研究發(fā)現(xiàn)，體外原代培養(yǎng)的HSCs在自動(dòng)活化過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)SAM水平下降，DNA甲基化水平降低，進(jìn)而促進(jìn)HSCs活化[6]。同時(shí)，有研究表明SAM能調(diào)節(jié)原代培養(yǎng)HSCs的激活、增殖和收縮能力[3]，抑制HSCs的活化[7]，在肝纖維化的逆轉(zhuǎn)中起一定作用。SAM抗纖維化的相關(guān)作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，SAM可能通過(guò)抑制H2O2介導(dǎo)的信號(hào)通路而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-1產(chǎn)生以及膠原沉積[4,8]；Oliva等[9]發(fā)現(xiàn)SAM亦可能通過(guò)抑制Toll樣受體的上調(diào)而發(fā)揮抗纖維化作用。但SAM對(duì)活化HSCs的作用尚無(wú)足夠研究證據(jù)。國(guó)內(nèi)劉梅等[10]的研究表明SAM能顯著抑制活化HSCs的增殖，但目前尚無(wú)研究探討其機(jī)制。本研究以活化的人肝星狀細(xì)胞株LX-2作為研究對(duì)象，旨在探討SAM對(duì)HSCs增殖、細(xì)胞周期和凋亡等的影響。

本實(shí)驗(yàn)參照相關(guān)研究[3-4]設(shè)置SAM溶液濃度，并由預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)(3.0～8.0 mmol/L)，SAM能有效抑制LX-2細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴效應(yīng)，與Matsui等[3]的研究結(jié)果相符。為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)2.0、4.0 mmol/L SAM將LX-2細(xì)胞周期阻滯于S期，上調(diào)cyclin D1表達(dá)。推測(cè)SAM通過(guò)上調(diào)cyclin D1表達(dá)使LX-2細(xì)胞周期阻滯于S期，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，4.0、8.0 mmol/L SAM能明顯誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞凋亡；但晚期凋亡率無(wú)明顯差異，這可能是由于SAM處理時(shí)間較短所致。在非毒性濃度下(1.0、2.0 mmol/L SAM組細(xì)胞增殖和凋亡率與對(duì)照組無(wú)明顯差異)，SAM即可明顯抑制活化HSCs的標(biāo)志性分子α-SMA的蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)SAM能抑制活化HSCs。

綜上所述，SAM能抑制LX-2細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能為通過(guò)上調(diào)cyclin D1表達(dá)使LX-2細(xì)胞周期阻滯于S期；同時(shí)，SAM能誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞凋亡，下調(diào)α-SMA表達(dá)；提示SAM能通過(guò)影響HSCs的生物學(xué)行為而起抗纖維化作用，為進(jìn)一步探討SAM對(duì)HSCs的機(jī)制及其抗纖維化作用奠定一定分子基礎(chǔ)。

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