陳 英 陳 平 王唯一 孫蘊偉 章永平 袁耀宗

上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科(200025)

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是常見急腹癥之一，可繼發(fā)胰腺假性囊腫、胰腺壞死、感染等局部并發(fā)癥，并可發(fā)展為伴持續(xù)性多器官損傷的全身性并發(fā)癥。重度急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)病情兇險，進展迅速，死亡率高，多器官功能衰竭為SAP的主要死因，尤以并發(fā)急性肺損傷最為突出[1-2]。抵抗素樣分子-α(resistin-like molecule-α, RELM-α)亦可稱為FIZZ1(found in inflammatory zone 1)或低氧誘導有絲分裂因子(HIMF)，是一個富含半胱氨酸的分泌蛋白，含有117個氨基酸殘基，29%的氨基酸序列與抵抗素相同，主要分布于肺泡上皮細胞、脂肪細胞、單核細胞、巨噬細胞等， 具有刺激血管平滑肌細胞增殖、抗細胞凋亡、收縮血管、促進血管生成等功能[3-4]。目前，RELM-α在AP繼發(fā)急性肺損傷中的作用尚未完全明確。本研究通過檢測實驗性AP大鼠模型急性肺損傷時肺組織中RELM-α的表達變化，分析其表達與急性肺損傷程度和AP預后相關(guān)指標之間的關(guān)系，探討其在AP繼發(fā)急性肺損傷中的作用，旨在為該AP并發(fā)癥的臨床防治提供新思路。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

健康雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠45只，體質(zhì)量150～200 g，由上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院動物實驗室提供。

?；悄懰徕c、L-精氨酸(Sigma公司)；RIPA裂解液[生工生物工程(上海)股份有限公司]；BCA蛋白定量試劑盒、ECL試劑盒(Pierce公司)；兔抗鼠RELM-α多克隆抗體(Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG二抗(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

二、方法

1. 動物分組和模型建立：大鼠隨機分為急性壞死性胰腺炎(ANP)組、急性水腫性胰腺炎(AEP)組和正常對照組，每組15只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前禁食24 h、不禁水。ANP組大鼠以10%戊巴比妥鈉麻醉，取正中切口入腹，以血管夾夾閉膽總管，24號套管針由十二指腸前壁穿刺入胰管，通過微量注射泵 以0.1 mL/min勻速注入3.5%?；悄懰徕c(1 mL/kg)，1 min后胰腺出現(xiàn)出血、壞死樣改變，去除血管夾，逐層關(guān)腹。AEP組大鼠分3次，每次間隔 1 h，腹腔內(nèi)注射3 000 mg/kg 20% L-精氨酸溶液。正常對照組大鼠僅行開關(guān)腹手術(shù)。于造模16 h后處死大鼠，處死前暴露支氣管，結(jié)扎右側(cè)支氣管，穿刺左側(cè)支氣管，以預冷PBS灌洗5次，回收灌洗液。分別留取血液、胰腺和肺組織標本，用于后續(xù)各項檢測。

2. 胰腺、肺組織病理學觀察：取胰腺和右下肺葉組織，4%多聚甲醛溶液固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察組織病理學變化。參考Mikawa等[5]的研究方法，根據(jù)：①肺泡充血；②肺泡腔、間質(zhì)紅細胞滲出；③肺間質(zhì)細胞間隙或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集；④肺泡間隔增厚或透明膜形成四項指標對肺組織損傷行組織病理學評分。

3. 肺濕/干重系數(shù)測定：取適量肺組織稱量濕重，置于72 ℃干燥箱內(nèi)烘烤24 h后稱量干重，以肺濕/干重系數(shù)反映肺組織含水量。肺濕/干重系數(shù)=(濕重-干重)/干重×100%。

4. 支氣管肺泡灌洗液炎性細胞計數(shù)：取支氣管肺泡灌洗液，1 000×g離心10 min，棄上清液，細胞重懸于PBS，應(yīng)用細胞計數(shù)板于光學顯微鏡下計數(shù)中性粒細胞和巨噬細胞總數(shù)。

5. 血清CRP、淀粉酶檢測：血液標本3 000×g離心15 min，分離血清，送上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，采用Beckman X7型全自動生化分析儀檢測血清CRP、淀粉酶水平。

6. 蛋白質(zhì)印跡法測定肺組織RELM-α表達：取適量肺組織，RIPA裂解液溶解，抽提總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒定量。取20 μg蛋白樣品，電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，分別加入兔抗鼠RELM-α多克隆抗體(1∶500)、GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入HRP標記的IgG二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，ECL顯影。Bio-Rad數(shù)碼成像系統(tǒng)掃描圖片，應(yīng)用Quantity One軟件，以GAPDH為內(nèi)參照定量分析RELM-α灰度值。

7. 免疫組化法測定肺組織RELM-α表達：肺組織石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，修復抗原，滴加非免疫性羊血清，室溫孵育15 min，加入兔抗鼠RELM-α多克隆抗體(1∶100)，4 ℃孵育過夜，加入HRP標記的IgG二抗(1∶500)，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，乙醇脫水，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判斷：RELM-α免疫染色陽性為細胞質(zhì)和(或)細胞膜呈棕黃色。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、胰腺、肺組織病理學表現(xiàn)

ANP組胰腺組織可見間質(zhì)腫脹，炎性細胞浸潤，微血管壁結(jié)構(gòu)破壞，紅細胞滲出，腺泡細胞和脂肪細胞壞死；AEP組胰腺組織可見小葉間充血水腫，炎性細胞浸潤；正常對照組胰腺組織未見明顯病理學改變(見圖1)。

ANP組肺組織可見肺泡間質(zhì)腫脹，肺泡壁破壞，炎性細胞浸潤，微血管壁結(jié)構(gòu)破壞，肺泡內(nèi)出血；AEP組肺組織可見肺泡間質(zhì)充血水腫，少量炎性細胞浸潤；正常對照組肺組織未見明顯病理學改變(見圖2)。ANP組肺組織病理學評分較AEP組和正常對照組顯著升高(P<0.05)，AEP組與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

二、肺濕/干重系數(shù)和支氣管肺泡灌洗液炎性細胞數(shù)量

ANP組肺濕/干重系數(shù)較AEP組和正常對照組顯著升高(P<0.05)，AEP組與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。ANP組支氣管肺泡灌洗液中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量較AEP組和正常對照組顯著升高(P<0.05)，AEP組與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

三、血清CRP、淀粉酶水平

ANP組血清CRP和淀粉酶水平[(241±62) μg/mL；(2 926±952) μg/mL]較AEP組[(141±28) μg/mL；(1 544±230) μg/mL]和正常對照組[(128±25) μg/mL；(874±230) μg/mL]顯著升高(P<0.05)；AEP組血清淀粉酶水平較正常對照組顯著升高(P<0.05)，CRP水平與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A：ANP組；B：AEP組；C：正常對照組

A：ANP組；B：AEP組；C：正常對照組

表1 各組大鼠肺組織病理學評分、肺濕/干重系數(shù)、支氣管肺泡灌洗液炎性細胞數(shù)量比較

四、蛋白質(zhì)印跡法檢測肺組織RELM-α表達

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，ANP組肺組織RELM-α表達水平(0.32±0.05)較AEP組(0.20±0.06)和正常對照組(0.18±0.04)顯著升高(P<0.05)，AEP組與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖3)。

1 Da=0.9921 u

五、免疫組化法檢測RELM-α表達

免疫組化染色結(jié)果顯示，RELM-α在ANP組肺組織中呈高表達，在AEP組肺組織中呈中度表達，正常對照組呈低表達或不表達(見圖4)。

六、相關(guān)性分析

Spearman等級相關(guān)系數(shù)分析顯示，肺組織中的RELM-α表達水平與肺組織病理學評分、肺濕/干重系數(shù)、支氣管肺泡灌洗液炎性細胞數(shù)量呈正相關(guān)(rs=0.762，P<0.01；rs=0.753，P<0.01；rs=0.795，P<0.01)， 提示RELM-α表達水平可反映急性肺損傷程度。

線性回歸模型分析顯示，肺組織中的RELM-α表達水平與血清淀粉酶、CRP水平呈正相關(guān)(R=0.764，P<0.01；R=0.429，P<0.05)，提示RELM-α可作為AP預后判斷指標。

討 論

AP繼發(fā)急性肺損傷的發(fā)生率可達35%，病程中胰酶自身消化和單核巨噬細胞活化可激活中性粒細胞，釋放促炎介質(zhì)，并通過炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)使效應(yīng)級聯(lián)放大，誘導肺組織內(nèi)炎性細胞積聚、活化，引起急性肺損傷[2]。明確相關(guān)促炎介質(zhì)的變化對AP繼發(fā)急性肺損傷的防治具有重要意義。目前關(guān)于RELM-α在肺組織中作用的研究較多。Teng等[4]的研究顯示，RELM-α可促進肺血管收縮和肺動脈平滑肌細胞增殖，作用呈劑量依賴性，其縮血管效應(yīng)強于內(nèi)皮素和血管緊張素Ⅱ。Dong等[6]的研究指出，肺過敏性炎癥時，支氣管黏膜上皮細胞和Ⅱ型肺泡細胞中的RELM-α表達顯著升高，參與調(diào)節(jié)支氣管敏感性，與氣道高反應(yīng)性的發(fā)生有關(guān)。Liu等[7]對博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化模型的研究發(fā)現(xiàn)，RELM-α可誘導肺成纖維細胞分化和細胞外基質(zhì)沉積，促進間質(zhì)增生、纖維化。Holcomb等[3]的研究指出，RELM-α能顯著促進肺微小血管收縮，提高肺血管壓力。此外，Munitz等[8]的研究顯示，在RELM-α基因敲除的結(jié)腸炎小鼠模型中， 促炎介質(zhì)白細胞介素(IL)-6釋放減少，抗炎介質(zhì)IL-10釋放增加，相關(guān)機制與JNK活性降低有關(guān)。由此可見，RELM-α在血管調(diào)節(jié)、細胞增殖、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等方面均發(fā)揮一定作用，然而目前相關(guān)研究主要集中于過敏性哮喘、肺纖維化、缺氧性肺損傷等疾病，對AP繼發(fā)急性肺損傷的研究較少。

A：ANP組；B：AEP組；C：正常對照組

本研究以胰管內(nèi)注射牛磺膽酸鈉建立大鼠ANP繼發(fā)急性肺損傷模型，以腹腔內(nèi)注射L-精氨酸制備的大鼠AEP模型和僅施行假手術(shù)的大鼠作為對照，采用蛋白質(zhì)印跡法和免疫組化法檢測肺組織中RELM-α的表達和定位，并結(jié)合胰腺、肺組織病理學檢查、肺濕/干重系數(shù)、支氣管肺泡灌洗液炎性細胞數(shù)量以及血清CRP、淀粉酶水平的檢測結(jié)果，探討RELM-α在AP繼發(fā)急性肺損傷中的作用。結(jié)果顯示ANP組大鼠肺組織RELM-α表達水平、胰腺和肺組織損傷程度、肺濕/干重系數(shù)、支氣管肺泡灌洗液中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量、血清CRP和淀粉酶水平均較AEP組和正常對照組顯著升高，進一步行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，肺組織RELM-α表達水平與急性肺損傷的嚴重程度呈正相關(guān)。上述結(jié)果提示RELM-α在AP病理過程中可能作為促炎介質(zhì)，參與趨化和激活以中性粒細胞、巨噬細胞為主的炎性細胞，最終介導急性肺損傷發(fā)生。鑒于血清CRP、淀粉酶水平的變化在AP早期對判斷疾病轉(zhuǎn)歸具有重要價值，本研究對上述指標與肺組織RELM-α表達水平的關(guān)系行線性回歸模型分析，結(jié)果顯示RELM-α表達水平與上述指標呈正相關(guān)，提示RELM-α高表達可能與ANP的預后有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，在AP病程中，RELM-α作為促炎細胞因子，可能參與趨化、激活以中性粒細胞、巨噬細胞為主的炎性細胞，最終介導急性肺損傷發(fā)生，但相關(guān)機制有待進一步研究。此外，肺組織RELM-α表達水平尚與AP預后相關(guān)，可作為監(jiān)測AP預后的生物學標記物。

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