慕剛剛 于紅剛 李紅艷 李 維

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科1(430060) 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院綜合內(nèi)科2

胰腺癌是極度惡性的消化道腫瘤，位居癌癥死亡原因的第四位，過去10年間胰腺癌發(fā)病率逐年上升，全世界每年約227 000例患者死于胰腺癌，其5年生存率不足5%[1-2]。胰腺癌早期診斷困難，確診時多已發(fā)生局部浸潤或遠處轉(zhuǎn)移，喪失了早期手術(shù)切除的機會[3]。胰腺癌的高轉(zhuǎn)移率歸因于胰腺癌細胞的強運動、侵襲能力，目前吉西他濱等一線化療藥物對抑制胰腺癌的轉(zhuǎn)移效果欠佳，且多有化療耐藥性產(chǎn)生。研發(fā)有效抑制胰腺癌細胞黏附、侵襲運動、遠處轉(zhuǎn)移的輔助化療方式已成為目前胰腺癌研究的重點。

在眾多新型化療藥物的研究中，天然形式的百里醌(thymoquinone)受到越來越多的關(guān)注，1963年人們首次從黑種草(Nigella sativa)草籽中提取出具有多種生物活性的百里醌，其能有效抗氧化、抗炎癥，對糖尿病、動脈粥樣硬化有較好的療效[4]。百里醌還能有效抑制多種人腫瘤細胞增殖、運動、遷移以及腫瘤新生血管生成等腫瘤生物學(xué)特性[5]。大量體內(nèi)外實驗表明百里醌能抑制結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[6-8]。對人正常前列腺上皮細胞、小腸細胞、胰腺導(dǎo)管上皮細胞作用的研究表明百里醌對正常細胞無毒性損害作用[7,9-10]。本研究通過探討百里醌對人胰腺癌細胞體外運動、侵襲的作用及其可能的調(diào)控機制，旨在為百里醌能運用于胰腺癌的臨床輔助化療提供有效依據(jù)。

材料與方法

一、實驗材料

胎牛血清、RPMI-1640、青霉素-鏈霉素抗菌藥物購自美國Hyclone公司。Boyden小室購自美國Corning公司；MatrigelTM基質(zhì)膠購自美國BD Biosciences公司。兔抗β-actin、FAK、磷酸化Akt(Ser 473)抗體、小鼠抗Akt抗體、羊抗兔IgG (H+L)、F(ab’)2Fragment(Alexa Fluor?555 Conjugate)熒光二抗購自美國Cell Signaling Technology, Inc，纖維狀肌動蛋白(F-actin)標記的抗體Acti-stainTM488 Fluorescent Phalloidin購自Cytoskeleton，Inc.；HRP標記的山羊抗兔二抗均購自美國Santa Cruz公司；細胞核染色液4’，6 - 二脒-2’-苯基吲哚二鹽酸鹽(4’, 6-Diamidino-2’-phenylindole dihydrochloride， DAPI)購自Roche公司；百里醌購自美國Sigma公司。

二、實驗方法

1. 細胞培養(yǎng)：人胰腺癌細胞株BxPC-3購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。BxPC-3細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、適合濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁生長至約70%～80%密度時經(jīng)胰酶消化傳代培養(yǎng)。

2. 侵襲實驗：將MatrigelTM基質(zhì)膠4 ℃過夜溶解。經(jīng)稀釋的MatrigelTM基質(zhì)膠40 μL/室包被Boyden小室內(nèi)室底膜，4 ℃過夜，使用前加200 μL RPMI-1640于37 ℃水化30 min。取對數(shù)生長期的BxPC-3細胞，用含0.1% BSA的RPMI-1640培養(yǎng)液制備單細胞懸液1×106個/mL，取200 μL細胞懸液加入Boyden小室的內(nèi)室(孔徑8 μm)，其中包含不同濃度的百里醌(0、10、25 μmol/L)，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液600 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用棉球小心拭去內(nèi)室培養(yǎng)液和細胞，將內(nèi)室用4%多聚甲醛溶液固定15 min，Giemsa染色10 min，置于倒置顯微鏡下觀察。每個小室高倍鏡下(×200)隨機選取5個視野，計數(shù)各組穿透細胞數(shù)。細胞侵襲率(%)=(對照組平均穿透細胞數(shù)-實驗組平均穿透細胞數(shù))/對照組平均穿透細胞數(shù)×100%。

3. 運動實驗：基本步驟與侵襲實驗相同，僅Boyden小室內(nèi)室不包被MatrigelTM基質(zhì)膠。

4. 蛋白質(zhì)印跡法：選擇對數(shù)生長期的BxPC-3細胞，按1×105個細胞/孔接種至6孔板，待貼壁生長至70%～80%密度，分別給予0、10、25、50 μmol/L百里醌處理24 h。培養(yǎng)終止后，PBS洗滌2遍，加入細胞裂解液充分裂解并離心提取總蛋白。BCA法測定總蛋白濃度，取40 μg總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉/10% BSA溶液封閉非特異性位點。加入FAK、磷酸化Akt、Akt一抗(工作濃度均為1∶1 000)4 ℃孵育過夜；TBST洗滌，加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h；漂洗后經(jīng)ECL法顯色，X線膠片曝光。以β-actin蛋白為內(nèi)參照，實驗獨立重復(fù)3次。

5. 免疫熒光：收集對數(shù)生長期BxPC-3細胞，制備單細胞懸液并調(diào)整細胞濃度為2×104～3×104個/mL，接種于無菌蓋玻片。加入0、25 μmol/L百里醌培養(yǎng)12 h。PBS洗滌3遍，用預(yù)熱的4%多聚甲醛溶液固定15 min，0.3% Triton-X 100/PBS溶液穿透15 min，5% BSA/PBS+山羊非免疫血清溶液封閉1 h去除非特異性結(jié)合；加入1∶100稀釋的兔抗FAK一抗溶液，4 ℃濕盒孵育過夜；PBS洗滌3遍后加入1∶1 000稀釋的羊抗兔IgG(H+L)、F(ab’)2Fragment(Alexa Fluor?555 Conjugate)熒光二抗和1∶200稀釋的Acti-stainTM488 Fluorescent Phalloidin抗體，室溫濕盒孵育60 min；0.1 μg/mL DAPI染核 1 min，充分洗滌后用抗熒光淬滅劑封片；Olympus熒光顯微鏡下觀察。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、百里醌對胰腺癌BxPC-3細胞運動能力的影響

空白對照組、10 μmol/L、25 μmol/L百里醌組穿過微孔膜的細胞數(shù)分別為145±9、82±10、38±7，與空白對照組相比，10、25 μmol/L百里醌組細胞遷移運動透膜數(shù)顯著減少(P<0.05)，且25 μmol/L組細胞遷移數(shù)又明顯少于10 μmol/L組(P<0.05)(圖1)。兩組百里醌組的細胞運動抑制率分別為43.4%、73.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明百里醌能呈濃度依賴性地抑制人胰腺癌BxPC-3細胞的體外運動。

二、百里醌對胰腺癌BxPC-3細胞侵襲能力的影響

空白對照組、10 μmol/L、25 μmol/L百里醌組透膜細胞數(shù)分別為119±10、47±6、29±5，與空白對照組相比，10 μmol/L、25 μmol/L百里醌組BxPC-3細胞侵襲透膜數(shù)均顯著減少(P<0.05)，且25 μmol/L組細胞侵襲透膜數(shù)又明顯少于10 μmol/L組(P<0.05)(圖1)。兩組百里醌組的侵襲抑制率分別為60.5%、75.6%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明百里醌能呈濃度依賴性地抑制人胰腺癌BxPC-3細胞的體外侵襲。

三、百里醌對胰腺癌BxPC-3細胞FAK表達、 磷酸化Akt的影響

與空白對照組相比，10 μmol/L百里醌組BxPC-3細胞FAK表達、磷酸化Akt水平無明顯差異，而25、50 μmol/L百里醌組能明顯下調(diào)FAK、磷酸化Akt的表達，但25 μmol/L與50 μmol/L組間FAK、磷酸化Akt水平無明顯差異；各組間總Akt蛋白表達無明顯差異(圖2)。說明百里醌能明顯抑制BxPC-3細胞FAK表達和Akt Ser 473位點的磷酸化激活。

*與空白對照組比較，P<0.05

1 Da=0.992 1 u

四、百里醌對胰腺癌BxPC-3細胞FAK定位、黏著斑形成和F-actin集化的影響

25 μmol/L百里醌組BxPC-3細胞FAK表達明顯減少，F(xiàn)AK標記的黏著斑面積明顯縮小，彌散分布于胞質(zhì)，胞膜和細胞邊緣區(qū)聚集較少；F-actin多呈點狀分布，無明顯集化現(xiàn)象。而空白對照組細胞具有更強熒光標記的FAK表達，F(xiàn)AK表達量明顯較多，且黏著斑面積較大，數(shù)目較多，多集中在細胞膜邊緣區(qū)；F-actin多有集化，且與胞膜的黏著斑緊密相連，細胞骨架多向黏著斑分布密集區(qū)聚集(圖3)。表明百里醌能明顯抑制細胞黏著斑的形成，下調(diào)FAK表達，同時抑制F-actin集化的發(fā)生，進而降低細胞的黏附、侵襲和運動轉(zhuǎn)移。

圖3 百里醌對胰腺癌BxPC-3細胞FAK、黏著斑和F-actin的影響(箭頭所示處為FAK定位)

討 論

天然植物單體百里醌能有效抑制多種腫瘤細胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞體內(nèi)、體外的凋亡，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等[5]。有研究[10]證實百里醌同樣能有效抑制胰腺癌細胞增殖，促進細胞凋亡，但又不影響人正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞的生長。進一步對百里醌影響腫瘤其他生物學(xué)行為的研究[11-13]發(fā)現(xiàn)，其能有效抑制腫瘤新生血管的生成、增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性、抑制腫瘤細胞遷移運動等。

胰腺癌的轉(zhuǎn)移一個多步驟、多因素的過程，包括上皮細胞極性改變、腫瘤細胞間黏附改變、運動能力增強、癌細胞穿透基底膜、轉(zhuǎn)移灶新生血管生成等一系列變化[5]。其中腫瘤細胞依賴黏著斑黏附到細胞外基質(zhì)、破壞基底膜侵入血管或淋巴管是關(guān)鍵步驟，該過程需要腫瘤細胞的趨化性運動、侵入基底層的能力和單個細胞的遷移運動能力。癌細胞在遷移運動時，引導(dǎo)端形成大量突起，觸發(fā)肌動蛋白的聚合集化和尾端的收縮協(xié)調(diào)，導(dǎo)致細胞通過肌動球蛋白張力纖維產(chǎn)生對抗黏附的牽引力，促進細胞向引導(dǎo)端遷移運動。癌細胞遷移運動還涉及多種黏附蛋白、激酶、細胞因子及其所參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控，其中FAK是參與細胞黏著斑形成、翻轉(zhuǎn)的關(guān)鍵激酶[14]，同時也是誘導(dǎo)細胞骨架和引導(dǎo)端突起形成的關(guān)鍵信號調(diào)節(jié)蛋白。腫瘤細胞黏附時FAK發(fā)生活化，通過FAK-Src-Cas-Crk-Dock180/Ras、FAK-PI3K/Akt等多種信號通路的激活介導(dǎo)腫瘤細胞的極化、運動、侵襲，進而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移和惡化[15-16]。目前已知FAK在腫瘤細胞和腫瘤組織中明顯高表達，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)[17-19]。

Kolli-Bouhafs等[20]的研究發(fā)現(xiàn)百里醌通過抑制FAK的活化來抑制人惡性膠質(zhì)瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，這與本研究發(fā)現(xiàn)百里醌能抑制胰腺癌BxPC-3細胞中FAK表達、阻斷黏著斑的形成以及抑制F-actin聚合集化的結(jié)果相一致。FAK表達下調(diào)、活性降低依賴細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)腫瘤侵襲、遷移相關(guān)的廣泛信號調(diào)節(jié)蛋白的改變，如細胞外基質(zhì)中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-2、-9的活性下調(diào)、ERK或PI3K/Akt/NF-κB信號通路的抑制、F-actin的解聚等，這些級聯(lián)反應(yīng)直接或間接抑制了腫瘤細胞侵襲、遷移能力的降低。本研究中百里醌呈濃度依賴性地抑制胰腺癌BxPC-3細胞的體外運動、侵襲，且FAK表達下調(diào)，磷酸化Akt的激活受抑，說明百里醌可能是通過抑制FAK表達和Akt磷酸化水平來降低胰腺癌BxPC-3細胞的體外運動、侵襲能力。

綜上所述，百里醌通過下調(diào)FAK的表達，抑制黏著斑的形成和引導(dǎo)端聚集，繼而抑制Akt磷酸化水平，通過抑制FAK/PI3K/Akt通路，間接抑制人胰腺癌BxPC-3細胞的運動、侵襲和轉(zhuǎn)移，但具體的調(diào)控機制還有待進一步研究。本研究也為百里醌未來應(yīng)用于胰腺癌的輔助化療提供了新的證據(jù)。

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