張浩 熊心猜 冉玉平 劉婷 陳玉娟

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，南充 637000;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚科，成都 610041)

嗜脂性酵母馬拉色菌屬 (Malasseziaspp.)是人類及動(dòng)物皮膚表面常駐菌群，幾乎在所有成人皮膚上都可以培養(yǎng)出來(lái)。作為一種條件致病菌，根據(jù)其rRNA基因序列，馬拉色菌屬的分類現(xiàn)已擴(kuò)增至13個(gè)菌種，包括10個(gè)親人性嗜脂菌種:糠秕馬拉色 菌 (M.furfur)，合 軸 馬 拉 色 菌 (M.sympodialis)，球形馬拉色菌 (M.globosa)，斯洛菲馬拉色菌(M.slooffiae)，鈍形馬拉色菌(M.obtusa)，限制馬拉色菌 (M.restricta)，日本馬拉色菌 (M.japonica)，皮 膚 馬 拉 色 菌 (M.dermatis)，大和馬拉色菌 (M.yamatoensis)和娜拉馬拉色菌(M.nana)，以及3個(gè)親動(dòng)物性菌種:厚皮馬拉色菌 (M.pachydermatis)，羊馬拉色菌(M.caprae)和馬馬拉色菌 (M.equina)［1-10］。我們對(duì)來(lái)源于東南亞部分國(guó)家青年人群的馬拉色菌菌種進(jìn)行菌種鑒定，分析其構(gòu)成情況。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

標(biāo)本采集于2011年和2012年秋季來(lái)我校留學(xué)的尼泊爾、巴基斯坦、印度青年留學(xué)生以及當(dāng)年入學(xué)的中國(guó)大學(xué)新生，共285例。其中男168例，女117例，年齡18～26歲，平均20歲。在志愿者到校報(bào)到的1～2 d內(nèi)予以標(biāo)本采集。

1.2 標(biāo)本采集和培養(yǎng)

簽署知情同意書后，使用TregadermaTM無(wú)菌透明敷貼 (3 cm×7 cm)，采集正常志愿者皮脂溢出豐富區(qū)(額頭、左右面頰)或相關(guān)疾病 (花斑糠疹、脂溢性皮炎、痤瘡，均臨床診斷明確)患者皮損區(qū)鱗屑標(biāo)本［11］。將敷貼置于Leeming＆Notman培養(yǎng)基(葡萄糖5 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏0.1 g，牛膽鹽4 g，甘油 1 mL，單硬脂酸甘油酯 0.5 g，0.5 mL 吐溫60，1%10 mL 全脂牛奶，2% 橄欖油，瓊脂 14 g，0.05%氯霉素，0.05%放線菌酮，加蒸餾水至1 000 mL)中，32℃培養(yǎng)7～10 d，待菌落生長(zhǎng)后挑取菌落進(jìn)行劃線接種和分離培養(yǎng)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

選用目前人所攜帶的10種馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)株，分別為糠秕馬拉色菌 (M.furfurCBS1878)、合軸馬拉色菌 (M.sympodialisCBS7222)、厚皮馬拉色菌 (M.pachydermatisCBS1879)、限制馬拉色菌(M.restrictaCBS7877)、球 形 馬 拉 色 菌 (M.globosaCBS7966)、鈍形 馬拉 色 菌 (M.obtusaCBS7876)、斯 洛 菲 馬 拉 色 菌 (M.slooffiaeCBS7956)，大 和 馬 拉 色 菌 (M.yamatoensisM9985)、日本馬拉色菌 (M.japonicaM9966)、皮膚馬拉色菌 (M.dermatisM9927)。日本Sugita教授和韓國(guó)Ahn教授惠贈(zèng)。

1.4 主要試劑

過(guò)氧化氫、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、氯霉素、放線菌酮 (Sigma Co.Ltd.，USA)，其余生化試劑購(gòu)于常州新華活性材料研究所。

1.5 生化和形態(tài)學(xué)鑒定

我們根據(jù)既往的國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道［3，5-8，10，12-14］，總結(jié)了目前所有馬拉色菌屬各菌種的表型特征 (見(jiàn)表1)，并據(jù)之進(jìn)行脂質(zhì)依賴試驗(yàn)、溫度生長(zhǎng)試驗(yàn)、吐溫生長(zhǎng)試驗(yàn)、蓖麻油試驗(yàn)、過(guò)氧化氫產(chǎn)氣試驗(yàn)、β-葡萄糖苷酶試驗(yàn)等鑒定菌種。

表1 馬拉色菌屬13個(gè)種的表型特征Tab.1 Phenotypic characteristics of all Malassezia species

1.6 質(zhì)量控制

以標(biāo)準(zhǔn)株作為對(duì)照。所有標(biāo)本在劃線分離后均分為3份，1份于-70℃下備份，另兩份由兩人獨(dú)立操作，分別進(jìn)行菌種鑒定并將結(jié)果相互印證，對(duì)結(jié)果出現(xiàn)差異的菌株，再次互相鑒定確認(rèn)，直至結(jié)果相互吻合。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

本次共收集了4個(gè)不同國(guó)家青少年人群 (中國(guó)185例;巴基斯坦32例;印度38例;尼泊爾30例)中馬拉色菌標(biāo)本，共分離出501株馬拉色菌菌株。志愿者的基本資料見(jiàn)表2。

2.2 菌種鑒定

分離出的501株馬拉色菌屬中，鑒定出8個(gè)菌種，以球形馬拉色菌為主，共計(jì)203株，占40.5%(203/501)。其次依次為合軸馬拉色菌19.0%(95/501)、糠秕馬拉色菌 16.0%(80/501)、限制馬拉色菌11.0%(55/501)、斯洛菲馬拉色菌6.2%(31/501)等。各菌種分布情況見(jiàn)表3。

表2 臨床志愿者基本情況Tab.2 Information of clinical volunteers

表3 來(lái)源于四個(gè)東南亞國(guó)家人群的馬拉色菌屬菌種鑒定情況(株)Tab.3 Identification results of Malassezia species from 285 volunteers from four countries in Southeast Asia(strain)

3 討 論

對(duì)于馬拉色菌在人正常皮膚及各相關(guān)性疾病中的菌種分布，國(guó)內(nèi)外有很多培養(yǎng)鑒定報(bào)道，結(jié)果有的相似，也有的存在較大差異，如有報(bào)道正常皮膚菌群以糠秕、合軸馬拉色菌為主的，也有報(bào)道以球形馬拉色菌為主，在相關(guān)性疾病如花斑糠疹中，有報(bào)道以合軸馬拉色菌為主，也有報(bào)道以球形馬拉色菌為主。這些差異原因多被認(rèn)為與地理環(huán)境有關(guān)［15-17］。但目前尚缺少一個(gè)全球性的馬拉色菌流行病學(xué)調(diào)查資料來(lái)證實(shí)這個(gè)觀點(diǎn)，而且目前的分子學(xué)技術(shù)應(yīng)用表明這些差異的原因很可能和常規(guī)的培養(yǎng)鑒定方法本身也有關(guān)系。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的分子學(xué)方法用于馬拉色菌菌種的鑒定。其中，不依賴培養(yǎng)的DNA直接提取鑒定法在馬拉色菌菌種鑒定及流行病學(xué)調(diào)查中展現(xiàn)其快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。常用的鑒定方法是將培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的菌落再行分離鑒定，其本身存在一定缺陷如結(jié)果判斷的主觀誤差、費(fèi)時(shí)、容易污染等。馬拉色菌做為嗜脂性酵母，對(duì)培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)要求高，加之不同菌種的生長(zhǎng)活性差異很大，容易造成培養(yǎng)中的假陰性，也不適用于全球流行病學(xué)調(diào)查及不同實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)共享及交流。我們首次在國(guó)內(nèi)應(yīng)用非培養(yǎng)法對(duì)脂溢性皮炎患者馬拉色菌菌種構(gòu)成進(jìn)行了鑒定［11］，其結(jié)果與循證統(tǒng)計(jì)［18］和國(guó)外脂溢性皮炎人群的馬拉色菌菌種構(gòu)成報(bào)道［19-21］相似，都以球形和限制馬拉色菌為主。但非培養(yǎng)法鑒定不能分離出活體菌種，不能保存實(shí)體菌種以及用于后續(xù)的表型研究等，所以常規(guī)培養(yǎng)鑒定仍是非常重要、不可或缺的方法。

本研究在國(guó)內(nèi)首次對(duì)目前所有馬拉色菌菌種的生理生化鑒定特性進(jìn)行了總結(jié)，并首次對(duì)東南亞部分國(guó)家青少年健康人群及馬拉色菌相關(guān)疾病患者的馬拉色菌菌種進(jìn)行培養(yǎng)鑒定分析。為了盡量降低上述的常規(guī)培養(yǎng)鑒定法誤差，我們以標(biāo)準(zhǔn)株作為對(duì)照，并以兩人獨(dú)立操作進(jìn)行質(zhì)量控制。其結(jié)果表明，來(lái)自四個(gè)東南亞國(guó)家青少年人群的馬拉色菌屬均以球形馬拉色菌為主，且無(wú)論是健康志愿者還是相關(guān)疾病患者，球形馬拉色菌均為主要菌種，且與患者的性別也沒(méi)有關(guān)系，這與我們以及國(guó)外進(jìn)行的非培養(yǎng)馬拉色菌菌種鑒定結(jié)果一致［11，19-21］。在本實(shí)驗(yàn)納入的四個(gè)東南亞國(guó)家中，優(yōu)勢(shì)菌種都為球形馬拉色菌、合軸馬拉色菌和糠秕馬拉色菌，并未見(jiàn)明顯的地理學(xué)差異，提示既往不同的培養(yǎng)鑒定研究報(bào)道的結(jié)果差異可能與培養(yǎng)方法本身有一定關(guān)系，故要求采取培養(yǎng)后表型鑒定法時(shí)一定要嚴(yán)格按方法進(jìn)行操作，并最好兩人以上獨(dú)立操作后對(duì)照比較，以降低主觀誤差和假陰性率。當(dāng)然，由于條件所限，本實(shí)驗(yàn)納入的東南亞國(guó)家數(shù)以及相關(guān)人數(shù)均較少，結(jié)果具有一定提示意義，需要后續(xù)更大樣本量的研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。

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