雷文知 桑軍軍 潘煒華 廖萬清

(上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

隱球菌性腦膜炎是由隱球菌引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，該病預(yù)后嚴(yán)重，死亡率高。隨著實(shí)體器官移植術(shù)的廣泛開展，免疫抑制劑的大量使用以及HIV感染者的逐步增多，隱球菌性腦膜炎的發(fā)病率逐年上升。在HIV感染患者中，并發(fā)隱球菌性腦膜炎后3個月內(nèi)的平均死亡率高達(dá)65.2%［1］，在器官和骨髓移植人群中的死亡率亦高達(dá)50%。所以隱球菌感染與機(jī)體免疫的相互作用一直是研究的熱點(diǎn)。

Th9和Th17是近年來新發(fā)現(xiàn)的CD4+T輔助細(xì)胞亞群，研究認(rèn)為Th9細(xì)胞是促炎細(xì)胞，在一些自身免疫病和變態(tài)反應(yīng)性疾病模型中具有促進(jìn)炎癥發(fā)展的作用［2］。Th17主要分泌 IL-17，它在炎癥和自身免疫方面也起著很重要的作用，在結(jié)核分枝桿菌感染中Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)揮重要致炎作用［3］。但Th9和Th17是否在真菌感染中的免疫機(jī)制中發(fā)揮作用目前仍缺乏相關(guān)研究，由于Th17細(xì)胞也可以促進(jìn)IL-9的分泌［2］，且Th9和Th17具有相同的刺激分化因子TGF-β［4］，這兩者之間是否存在協(xié)同致炎作用也有待研究。本實(shí)驗(yàn)的目的在于通過比較Th9和Th17細(xì)胞在隱球菌性腦膜炎患者和健康對照外周血CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)水平并分析兩者相關(guān)性，初步探討Th9和Th17免疫途徑在隱球菌腦膜炎發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究資料

研究對象 選擇自2013年4月～2014年2月在上海長征醫(yī)院及華山醫(yī)院住院治療的隱球菌腦膜炎患者12例，其中男10例，女2例，年齡為23～61歲，平均43.4歲，所有患者均為初診患者，病程7～40 d，平均17.8 d，第1次抽血前均未接受過抗真菌治療(A組)，第2次抽血為治療后3周 (B組)。患者臨床表現(xiàn)為頭痛、嘔吐、發(fā)熱等，腦脊液墨汁涂片發(fā)現(xiàn)隱球菌，腦脊液真菌培養(yǎng)為隱球菌生長或腦脊液乳膠凝集滴度大于1∶8，符合隱球菌性腦膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。健康對照組12例(C組)，其中男10例，女2例，年齡為26～63歲，平均43.3歲，均來自本院體檢健康者，兩組之間年齡、性別無統(tǒng)計學(xué)差異。入組者均簽訂知情同意書。

療效評估及治療好轉(zhuǎn)患者選擇標(biāo)準(zhǔn) 治愈為臨床癥狀消失，腦脊液培養(yǎng)連續(xù)3次 (每周1次)為陰性;好轉(zhuǎn)為臨床癥狀明顯改善，腦脊液墨汁染色隱球菌計數(shù)減少，腦脊液乳膠凝集滴度下降，腦脊液培養(yǎng)隱球菌生長時間延長;無效是指臨床癥狀無明顯改善，腦脊液墨汁染色隱球菌計數(shù)無明顯變化，培養(yǎng)仍陽性。按照美國IDSA2010年頒布的隱球菌病治療指南［5］隱球菌性腦膜炎的誘導(dǎo)治療分為2周和4周，我們既往治療觀察隱球菌性腦膜炎患者好轉(zhuǎn)的時間多為2～4周，所以本實(shí)驗(yàn)選擇治療后3周為第2次采血點(diǎn)及療效評估點(diǎn)。此次觀察的12例隱球菌性腦膜炎患者在治療3周后評定為好轉(zhuǎn)以上的病例為8例，無效者為4例。

1.2 方法

標(biāo)本采集及制備 用肝素鈉抗凝管采取靜脈血5 mL，2 h內(nèi)分離外周血單核細(xì)胞 (PBMC)，用RPMI 1640(含10%熱滅活FBS)重懸單個核細(xì)胞，用臺盼蘭染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)在95%以上，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106細(xì)胞/mL。

流式細(xì)胞學(xué)檢測 取上述標(biāo)本500 μL，加入250×佛波醇乙酯(PMA)/離子霉素2 μL和250*莫能霉素/布雷菲德菌素 (BFA)2 μL混勻，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，將培養(yǎng)好的細(xì)胞分成100 μL/管，分別加入CD3/CD8抗體，4℃避光孵育30 min，加入FIX/PERM破膜劑A 100 μL室溫孵育15 min，加入3 mL染色緩沖液300 g離心5 min后收集細(xì)胞，加入 FIX/PERM破膜劑 B 100 μL和 IL-17A抗體，混勻，室溫孵育20 min，加入3 mL染色緩沖液300 g離心5 min后收集細(xì)胞，0.5 mL PBS重懸后立即上機(jī)。1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0。計量資料以(±s)表示，組間外周血Th9與Th17細(xì)胞比率比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多樣本的相關(guān)性分析采用pearson雙變量相關(guān)性分析方法，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 隱球菌性腦膜炎患者治療前后和健康對照CD4+T細(xì)胞中Th9、Th17的比值

與正常對照相比，隱球菌性腦膜炎患者治療前CD4+T細(xì)胞中Th9細(xì)胞的比值與健康對照相比無顯著性差異，Th17細(xì)胞的比值較健康對照降低，P＜0.01;隱球菌性腦膜炎患者治療后Th9細(xì)胞的比值較前明顯升高，與治療前及健康對照相比均有顯著性差異，P＜0.05，Th17細(xì)胞較治療前顯著性升高，P＜0.01，但與健康對照相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (見表1、圖1)。

2.2 治療好轉(zhuǎn)的隱球菌性腦膜炎患者治療前后和健康對照CD4+T細(xì)胞中Th9、Th17的比值

評價為好轉(zhuǎn)的患者CD4+T細(xì)胞中Th9細(xì)胞的比值變化與整體患者的比值變化表現(xiàn)出同樣的趨勢;Th17細(xì)胞的比值在治療后明顯上調(diào)，與治療前及健康對照相比均有顯著性差異，P＜0.01(見表 2、圖2)。

2.3 治療無效的隱球菌性腦膜炎患者治療前后和健康對照CD4+T細(xì)胞中Th9、Th17的比值

治療無效的患者CD4+T細(xì)胞中Th9細(xì)胞的比值無論是在治療前還是治療后于健康對照相比均無顯著性差異;Th17細(xì)胞的比值無論是在治療前還是治療后與健康對照相比均顯著性降低，兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (見表3、圖3)。

表1 隱球菌性腦膜炎患者治療前后和正常對照CD4+T細(xì)胞中Th9、Th17的比值Tab.1 The ratios of Th9 and Th17 cells in CD4+T cells among CM patients group before and after treatment and the normal group

表2 治療好轉(zhuǎn)的隱球菌性腦膜炎患者治療前后和正常對照CD4+T細(xì)胞中Th9、Th17的比值Tab.2 The ratios of Th9 and Th17 cells in CD4+T cells among improved CM patients group before and after treatment and the normal group

表3 治療無效的隱球菌性腦膜炎患者治療前后和正常對照CD4+T細(xì)胞中Th9、Th17的比值Tab.3 The ratios of Th9 and Th17 cells in CD4+T cells among CM patients who resistant to treatment before and after treatment and the normal control

2.4 Th9和Th17細(xì)胞比值的相關(guān)性分析

無論是在整體患者或是治療好轉(zhuǎn)患者治療后Th9和Th17細(xì)胞比值之間有正相關(guān)趨勢，但兩者相關(guān)性統(tǒng)計學(xué)分析均無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05(見圖4)。

3 討 論

隱球菌性腦膜炎好發(fā)于青壯年，在AIDS患者中發(fā)病率極高，該病起病隱匿，由于缺乏早期、特異的診斷方法和高效、低毒的抗真菌藥物，死亡率和致殘率高，深入了解隱球菌性腦膜炎患者感染隱球菌后的免疫反應(yīng)機(jī)制、尋找新的治療方法對降低隱球菌性腦膜炎的發(fā)病率和死亡率有至關(guān)重要的意義。

普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為天然免疫是機(jī)體抵抗隱球菌侵入的第一道防線，但近期有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞吞噬隱球菌后并不能有效殺死病菌，反而會促進(jìn)隱球菌在體內(nèi)的播散［6］，而特異性的細(xì)胞免疫卻在抵抗隱球菌侵襲中發(fā)揮著重要作用［7］。其中T淋巴細(xì)胞免疫在清除隱球菌感染方面至關(guān)重要［8］。宿主細(xì)胞免疫系統(tǒng)可以通過釋放細(xì)胞因子調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞清除病原體的能力。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)打破了以往認(rèn)為CD4+T細(xì)胞僅有 Th1和 Th2兩個亞群的學(xué)說，Dardalhon［9］在2008年率先提出了一種以分泌IL-9、IL-10為主的新型效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞，定義為Th9細(xì)胞亞群，其在自身免疫性疾病、微生物感染、過敏性疾病中起作用，在大腸炎小鼠模型中，若注入Th9細(xì)胞，可以導(dǎo)致結(jié)腸炎癥的加劇，表明Th9細(xì)胞具有促炎作用。在肝炎病毒感染患者中，Th9細(xì)胞的高表達(dá)不利于丙型肝炎病毒的清除［10］。而Th17細(xì)胞亞群主要分泌IL-17，與多種炎癥疾病和自身免疫病發(fā)病密切相關(guān)。Zelante［11］研究發(fā)現(xiàn)在白念珠菌及煙曲霉菌感染的小鼠模型中，Th17和IL-23旁路通過抑制Th1的保護(hù)性免疫而促進(jìn)真菌感染后的炎癥發(fā)生，同時實(shí)驗(yàn)表明若阻斷Th17和IL-23的表達(dá)可以增加小鼠對于白念珠菌及煙曲霉的免疫耐受性，所以認(rèn)為Th17在抗真菌感染中起促進(jìn)作用。但是Khader的研究持相反的觀點(diǎn)［12］，他成功建立了結(jié)核分枝桿菌感染小鼠模型，認(rèn)為抗結(jié)核分枝桿菌疫苗的作用機(jī)制是通過誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞中IL-17的表達(dá)，激發(fā)CXCL9/CXCL10等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素-γ，而抑制細(xì)菌的生長。Murdock在肺部隱球菌感染小鼠模型中的研究中也認(rèn)為Th17細(xì)胞增高對清除隱球菌感染具有積極的作用［13］。

我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，隱球菌性腦膜炎患者在治療前CD4+T細(xì)胞中Th9細(xì)胞的比值與正常對照相比無統(tǒng)計學(xué)差異，但Th17細(xì)胞的比值與健康對照相比明顯下調(diào)，經(jīng)過治療后，Th9和Th17細(xì)胞的比值均明顯升高，以Th17的升高更為明顯，且在治療好轉(zhuǎn)的患者中差異更大，而治療無效的患者Th9和Th17細(xì)胞的比值在治療前后均無統(tǒng)計學(xué)差異。我們推測，Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫通路對于隱球菌性腦膜炎患者有效清除隱球菌的感染起重要作用，而Th17細(xì)胞的缺乏或者不應(yīng)答是導(dǎo)致隱球菌性腦膜炎患者中隱球菌產(chǎn)生免疫逃逸的重要突破口。在小鼠實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)IL-17A缺陷小鼠具有較低的真菌清除能力［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞在特定條件下也能大量分泌IL-9，正向調(diào)節(jié)Th9細(xì)胞的產(chǎn)生［14］。在體外培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞的減少可能導(dǎo)致IL-9和IL-9受體的衰減［15］。我們實(shí)驗(yàn)也觀察到，隨著Th17細(xì)胞比值的升高，Th9細(xì)胞在治療后的隱球菌性腦膜炎患者中比值也與健康對照相比有明顯上調(diào)，為分析此次實(shí)驗(yàn)中Th9細(xì)胞比值的上調(diào)是否與Th17細(xì)胞相關(guān)，我們對治療后Th9和Th17細(xì)胞比值進(jìn)行相關(guān)性分析，但無論是在治療好轉(zhuǎn)或無效的患者中均未發(fā)現(xiàn)兩者的顯著相關(guān)性。這可能與我們此次實(shí)驗(yàn)中觀察的病例數(shù)較少有關(guān)。

圖1 隱球菌性腦膜炎患者治療前后和正常對照CD4+T細(xì)胞中Th9、Th17的比值 圖2 治療好轉(zhuǎn)的隱球菌性腦膜炎患者治療前后和正常對照CD4+T細(xì)胞中Th9、Th17的比值 圖3 治療無效的隱球菌性腦膜炎患者治療前后和正常對照CD4+T細(xì)胞中Th9、Th17的比值圖4 a.隱球菌性腦膜炎患者治療后Th9和Th17比值相關(guān)性分析，b.治療好轉(zhuǎn)的隱球菌性腦膜炎患者治療后Th9和Th17比值相關(guān)性分析Fig.1 The ratios of Th9 and Th17 cells in CD4+T cells among CM patients group before and after treatment and the normal group Fig.2 The ratios of Th9 and Th17 cells in CD4+T cells among improved CM patients group before and after treatment and the normal group Fig.3 The ratios of Th9 and Th17 cells in CD4+T cells among CM patients who resistant to treatment before and after treatment and the normal control Fig.4 a.Correlation analysis of Th9 and Th17 in CM patients after treatment，b.Correlation analysis of Th9 and Th17 in improved CM patients after treatment

Th17和Th9細(xì)胞如何發(fā)揮清除隱球菌感染的確切機(jī)制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)在漆酶缺陷的隱球菌感染小鼠模型中，Th1和Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子明顯增加，其中IL-17的增加出現(xiàn)時間更早，認(rèn)為Th17細(xì)胞能與Th1細(xì)胞共同作用，對于預(yù)防和降低隱球菌在腦脊液中的擴(kuò)散具有保護(hù)作用［16］。在肺炎克雷伯菌感染的肺炎中，Th17細(xì)胞可以通過趨化TNF-α、IL-1β、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2、粒細(xì)胞集落刺激因子等至感染部位，以增強(qiáng)對細(xì)菌的清除率，抵抗肺炎克雷伯菌的攻擊［17］。而IL-9在巴西鉤蟲感染中認(rèn)為可以激活先天性淋巴樣細(xì)胞，調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞增強(qiáng)對病原菌的殺傷作用［18］。所以我們推測，在隱球菌性腦膜炎患者中，Th17細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)其他輔助T細(xì)胞如Th1、Th9細(xì)胞的分泌，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬殺傷隱球菌的功能來達(dá)到抵御隱球菌感染的目的。而Th17細(xì)胞在未治療隱球菌性腦膜炎患者及隱球菌性腦膜炎治療后無好轉(zhuǎn)患者中的表達(dá)下調(diào)可能是這一系列免疫反應(yīng)無法應(yīng)答，導(dǎo)致隱球菌性腦膜炎發(fā)病及隱球菌治療抵抗的根源。隱球菌性腦膜炎患者中Th17細(xì)胞的具體免疫調(diào)控功能還需進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為尋找抵御隱球菌感染疫苗制備及免疫治療靶點(diǎn)的選擇提供了新的思路。

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