王雪潔 萬喆 李若瑜 劉偉

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心 皮膚病分子診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034)

近30 a來，人類的真菌感染率顯著增高［1］。而在能感染人類的條件性致病真菌中，又以念珠菌和曲霉最為常見。其中，以白念珠菌 (Candida albicans)為主的念珠菌屬是引起侵襲性真菌感染的首要致病真菌［2］。近年來國內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查研究表明，雖然白念珠菌的分離率有所下降，但是對氟康唑 (fluconazole，F(xiàn)LU)敏感性差的近平滑念菌(C andida parapsilosis)和熱帶念珠菌(Candida tropicalis)等的比例正在升高［3-4］。曲霉是僅次于念珠菌的第二大深部致病真菌，且近年來發(fā)病率有逐漸升高的趨勢。其中煙曲霉(Aspergillus fumigatus)是引起侵襲性曲霉病最主要的病原菌［5］，并且已成為該類患者最常見的死亡原因［6］。

隨著臨床治療中FLU、伊曲康唑 (itraconazole，ITC)的應(yīng)用日益頻繁，耐FLU的念珠菌以及耐ITC的煙曲霉臨床分離株正在逐漸增多，而且往往導(dǎo)致患者應(yīng)用FLU或者ITC治療失?。?］。因此選擇高效、敏感的新型抗真菌藥物來治療這些耐藥菌株引起的感染具有十分重要的意義。泊沙康唑(posaconazole，POS)是一種新型廣譜三唑類抗真菌藥物，具有良好的藥物動力學(xué)，對難治性侵襲性真菌病有預(yù)防和治療的作用［8］。為了驗(yàn)證POS對耐FLU念珠菌和耐ITC曲霉的作用，我們參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(clinical laboratory standard institute，CLSI)頒布的酵母菌藥敏實(shí)驗(yàn)方案 M27-A3［9］和絲狀菌藥敏實(shí)驗(yàn)方案 M38-A2［10］方案，以微量液基稀釋法測定11株耐FLU的念珠菌和3株耐ITC的曲霉對 FLU、ITC、伏立康唑 (voriconazole，VRC)和POS的敏感性。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 受試菌株

11株耐FLU的念珠菌和3株耐ITC的煙曲霉，均為臨床分離菌株，來源于患者的血液和尿液。菌株保存于北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科真菌室、北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心?？拐婢幬锩舾行栽囼?yàn)所用質(zhì)控株為近平滑念珠菌ATCC22019和克柔念珠菌(Candida krusei)ATCC6258。

1.2 試驗(yàn)用藥物

所有藥物均以原料粉形式提供。FLU(Sigma-Aldrich公司，批號 200606040，純度 98.83%)用無菌雙蒸水溶解，儲存液的濃度為1 600 μg/mL;ITC(中國藥品生物制品檢定所，批號100631-200401，純度 99.3%)、VRC(山東省壽光富康制藥公司，批號070724，純度99.3%)和POS(Merck公司，批號 171228-49-2，純度 ＞99%)，用100%分析純度二甲基亞砜 (dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，儲存液的濃度為 1 600 μg/mL，藥物儲存液于-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌懸液制備

菌懸液制備:受試菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基，念珠菌35℃活化2 d，煙曲霉35℃活化7 d。取PDA上的菌落，加入4 mL生理鹽水，反復(fù)吹吸混勻后，將菌懸液吸到無菌試管中。對于念珠菌，在530 nm波長的比濁儀上，利用無菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，再用血球計?shù)板計數(shù)至 (1～5)×106/mL。菌懸液用RPMI1640液體培養(yǎng)基稀釋20倍，再稀釋100倍，制備成工作濃度的菌懸液，得到 (0.5～2.5)×103CFU/mL的接種菌懸液。對于曲霉菌懸液，以血球計數(shù)板調(diào)整孢子濃度為1×106/mL～5×106/mL，再以 RPMI1640液體培養(yǎng)基進(jìn)一步稀釋50倍，即為2倍于最終接種濃度的孢子懸液。

1.4 抗真菌藥物體外抑菌活性測定

參照CLSI制定的酵母藥敏方案M27-A3和絲狀真菌藥敏方案M38-A2。采用微量液基稀釋法，分別將FLU、ITC、VRC和POS的藥物儲存液以RPMI1640液基倍比稀釋，配制成2倍于終濃度的藥液，加入96孔圓底藥敏板。FLU的工作濃度為 0.125 ～64 μg/mL，ITC、VRC 和 POS 的均為0.03 ～16 μg/mL。取 100 μL 藥液分別加入第 1～10列各孔，第11列中加入100 μL RPMI1640。第12列設(shè)立陰性對照。向第1～11孔分別加入100 μL菌懸液后，35℃孵育48 h判讀結(jié)果。對于念珠菌，F(xiàn)LU、ITC、VRC和POS的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)均定義為與生長對照孔相比生長50%受抑制所對應(yīng)的最低藥物濃度。對于曲霉，F(xiàn)LU、ITC、VRC和 POS的MIC均定義為與生長對照孔相比生長100%受抑制所對應(yīng)的最低藥物濃度。對于念珠菌屬，F(xiàn)LU，MIC≤16 μg/mL 為敏感，MIC=16 ～ 32 μg/mL為劑量依賴性敏感，MIC≥64 μg/mL為耐藥;ITC，MIC≤0.125 μg/mL 為敏感，MIC=0.25 ～0.5 μg/mL 為劑量依賴性敏感，MIC≥1 μg/mL 為耐藥;VRC，MIC≤1 μg/mL 為敏感，MIC=2 μg/mL為劑量依賴性敏感，MIC≥4 μg/mL 為耐藥［9］。有些文獻(xiàn)認(rèn)為，對于 POS，MIC＞32 μg/mL為耐藥［11］。對于曲霉屬，ITC 和 VRC，MIC ＜2 μg/mL為敏感，MIC=2 μg/mL 為中介，MIC ＞2 μg/mL為耐藥;POS，MIC ＜ 0.25 μg/mL 為敏感，MIC=0.5 μg/mL 為中介，而 MIC ＞ 0.5 μg/mL 為耐藥［12］。所有藥敏試驗(yàn)均重復(fù)操作3遍。

2 結(jié) 果

四種藥物對念珠菌和曲霉的體外抑菌作用

對于11株念珠菌，F(xiàn)LU的MIC值均為64 μg/mL，ITC 的 MIC 范圍是 0.5 ～ 16 μg/mL，VRC 的MIC 范圍是0.25～2 μg/mL，POS的MIC 范圍是0.125～1 μg/mL。根據(jù)判讀標(biāo)準(zhǔn)，11株念珠菌均對氟康唑耐藥。

對于 3株曲霉，ITC的 MIC均 ＞16 μg/mL，VRC的MIC范圍是1～2 μg/mL，POS的MIC范圍是 0.25 ～ 0.5 μg/mL。根據(jù)判讀標(biāo)準(zhǔn)，煙曲霉對ITC均耐藥，但對POS為敏感或中介。

表1 FLU、ITC、VRC和POS對14株病原真菌的最低抑菌濃度 (MIC)(μg/mL)Tab.1 The MIC results of 14 pathogenic fungi to FLU，ITC，VRC and POS(μg/mL)

3 討 論

念珠菌是引起黏膜和深部組織真菌感染的主要病原菌。近年來，由于免疫抑制劑的使用，念珠菌等條件致病菌的感染率大幅上升［13］。隨著抗真菌藥物在臨床的廣泛使用，尤其是使用FLU來預(yù)防高危人群的真菌感染，耐藥念珠菌不斷出現(xiàn)，并且對抗真菌藥物敏感性低的非白念珠菌也在增多［14］。對唑類藥物耐藥的曲霉主要為煙曲霉，且曲霉對唑類藥物敏感性相對較低［14］。其耐藥株在比利時、加拿大、中國、丹麥、法國、挪威、西班牙、瑞典、荷蘭、英國和美國等國家均有報道［14］。國外有報道稱，近年來唑類耐藥情況有顯著增長趨勢［15］。在有些地區(qū)，曲霉已成為引起侵襲性真菌病 (invasive fungal disease，IFD)的首要因素。而在中國，念珠菌引起的侵襲性真菌感染最為常見，其次是曲霉［15］。

目前，治療侵襲性真菌感染的常用藥物包括三唑類藥物、多烯類藥物兩性霉素B(amphotericin B，AMB)、棘白霉素類藥物卡泊芬凈 (caspofungin，CAS)以及氟胞嘧啶 (flucytosine)等。三唑類藥物又包括FLU、ITC、VRC以及POS等。由于唑類藥物具有高效性、低毒性和抗菌譜廣的特點(diǎn)，在臨床上廣泛應(yīng)用［16］。而隨著唑類藥物的廣泛應(yīng)用，耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。在念珠菌中，F(xiàn)LU的耐藥性與藥物靶酶的改變、外排泵基因過度表達(dá)以及熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)有關(guān)，與菌株生物膜的形成也有一定的聯(lián)系［17］。目前認(rèn)為，煙曲霉對三唑類藥物的耐藥機(jī)制與外排泵基因、HSP90、外源性膽固醇的攝入，cyp51A基因過表達(dá)或者靶酶突變等因素有關(guān)［18］。耐藥真菌給治療造成了更大的困難，臨床治療效果受到嚴(yán)重影響［19］。

新型唑類藥物POS從ITC衍化而來，其結(jié)構(gòu)類似，三唑側(cè)鏈苯環(huán)上的氟和羥基被氯所取代，因此增強(qiáng)其效能和活性譜［19］。POS的作用機(jī)制是抑制真菌細(xì)胞膜麥角固醇合成關(guān)鍵酶--甾醇14α-去甲基 化 酶 (sterol14α-demethylase，P45014DM，CYP51)。因麥角固醇與真菌細(xì)胞膜的合成有關(guān)，該酶的改變不僅可以導(dǎo)致麥角固醇合成的缺失，而且可以造成有害的甲基甾醇前體的堆積［6］，最終致真菌死亡。有人曾研究了在POS中白念珠菌、近平滑念珠菌、煙曲霉和黃曲霉的麥角固醇合成。結(jié)果表明，在這些菌種中，POS都能抑制麥角固醇合成，且呈劑量依賴性［19］。

體外試驗(yàn)證實(shí)，POS的抗菌譜近似于AMB，較其它三唑類藥物更廣，并且耐受性好［6］。一直以來，AMB都被認(rèn)為是治療嚴(yán)重真菌感染的首選藥物，但是它的腎毒性和輸液相關(guān)事件限制了其應(yīng)用［19］。POS對包括念珠菌、曲霉、接合菌在內(nèi)的多種致病真菌有殺傷或者抑制作用，尤其是對耐藥的難治性或侵襲性真菌感染 (如曲霉，鐮刀菌屬、接合菌和球孢子菌)有效［7］。在預(yù)防侵襲性真菌病方面，比FLU或者ITC更有效［20］。POS對克柔念珠菌和葡萄牙念珠菌有殺菌作用，對其他很多念珠菌有抑菌作用［7］。在小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，POS對侵襲性曲霉病、接合菌病、鐮刀菌病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)暗色絲孢霉病、組織胞漿菌病、芽生菌病和球孢子菌病均有效［7］。

POS已經(jīng)被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)用于治療口咽念珠菌病，包括對FLU和/或ITC耐藥菌株的感染，以及可以用于13歲以上嚴(yán)重免疫缺陷的患者的侵襲性曲霉和念珠菌感染的預(yù)防［7］。此外，歐盟委員會還允許其用于難治性疾病或者無法耐受常用抗真菌藥物的成人患者的侵襲性曲霉病、鐮刀菌病、慢性芽生菌病、分支菌病和球孢子菌病的治療［8］。雖然VRC對接合菌沒有作用，但是POS對接合菌依然有效［15］。有研究表明，對于 IFD、POS與 FLU在預(yù)防IFD時同樣有效;在治療造血干細(xì)胞移植患者的侵襲性曲霉病時，POS要優(yōu)于FLU［20］。

本實(shí)驗(yàn)表明，POS對耐FLU的念珠菌和耐ITC的煙曲霉有良好的抗菌作用，這與以前的研究一致［8］。FLU 對念珠菌的 MIC 值是 64 μg/mL，ITC對煙曲霉的MIC范圍＞16 μg/mL，受試菌株均表現(xiàn)出明顯的耐藥性。而POS對所有菌株的MIC范圍是0.125～1 μg/mL，說明受試菌株對 POS均有良好的敏感性。念珠菌和曲霉對VRC和POS均不耐藥，但是受試真菌對于兩種藥的敏感性略有不同。對于白念珠菌，POS的MIC值不高于VRC。VRC對煙曲霉的MIC值為1～2 μg/mL，而POS對煙曲霉的MIC均＜1 μg/mL。泊沙康唑是伊曲康唑基礎(chǔ)上改造而來將伊曲康唑的三唑側(cè)鏈苯環(huán)上的氟和羥基以氯取代，這種改造增強(qiáng)了其抗真菌活性并拓寬了抗菌譜［21］。受試菌株對FLU和ITC耐藥，卻對新型抗真菌唑類藥物POS敏感，對臨床選擇用藥有重要意義。POS不僅抗菌譜廣泛，還對一些FLU和ITC耐藥的菌株有效，這與其他人的研究一致［6］。綜上，我們認(rèn)為，在治療耐藥性念珠菌和曲霉方面，POS是一種有效的藥物。

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