廣東省清遠(yuǎn)市食品藥品檢驗(yàn)所,廣東 清遠(yuǎn) 511500

丹芍康婦丸中赤芍苷的含量測(cè)定方法研究

曾小平熊亦禹

廣東省清遠(yuǎn)市食品藥品檢驗(yàn)所,廣東 清遠(yuǎn) 511500

目的建立以HPLC法測(cè)定丹芍康婦丸中赤芍含量的新方法。方法采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；以乙腈-水(15∶85)為流動(dòng)相；流速為1.0ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。結(jié)果芍藥苷對(duì)照品濃度在5.84～292.0μg/ml之間與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.9999。加樣平均回收率為98.9%，RSD=2.50%。結(jié)論此方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可為丹芍康婦丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

高效液相色譜法；丹芍康婦丸；赤芍；芍藥苷

丹芍康婦丸是由丹參、莪術(shù)、三七、赤芍、當(dāng)歸等藥材組成的復(fù)方制劑。紫丹參及莪術(shù)雖為方中君藥，但兩者并無(wú)可準(zhǔn)確定量的成分，赤芍為方中主藥，具散瘀止血的功效，因此，赤芍是丹芍康婦丸質(zhì)量控制的關(guān)鍵。研究表明，赤芍的主成分為芍藥苷，本實(shí)驗(yàn)在參考其他文獻(xiàn)[1,2]的基礎(chǔ)上，選擇芍藥苷的測(cè)定作為丹芍康婦丸質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，并通過(guò)試驗(yàn)建立HPLC測(cè)定丹芍康婦丸中芍藥苷含量的新方法，有望為該藥品的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

儀器：Dionex高效液相色譜儀，UVD340U檢測(cè)器，Chromeleon工作站；Sartorius電子天平。

試劑：乙腈為色譜純(LOT 602212，美國(guó)Tedia company inc.)；水為純化水；其他試劑為分析純。

對(duì)照品：芍藥苷(批號(hào)110736-200527，含量測(cè)定用)，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

供試品：丹芍康婦丸為廣州博濟(jì)醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)為091101，091102，091103、091104、091201、091202。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.1.1 色譜條件的選擇 色譜柱：參照赤芍藥材藥典標(biāo)準(zhǔn)[1]含量測(cè)定方法，用十八烷其鍵合硅膠為填充劑的Phenomenex Luna 5μ C18(2) 100A(4.6mm×250mm，5μ)為色譜柱。

測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：取芍藥苷對(duì)照品的甲醇溶液(63.6μg/ml)，在紫外分光光度計(jì)200～400nm波長(zhǎng)掃描。結(jié)果在228nm波長(zhǎng)處有最大吸收，與文獻(xiàn)所用的測(cè)定波長(zhǎng)(230nm)基本一致，故選擇230nm為本品的測(cè)定波長(zhǎng)(見(jiàn)圖10)。

流動(dòng)相的選擇：因《中國(guó)藥典》2010年版一部中赤芍含量測(cè)定中所用流動(dòng)相：甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀(40∶65)中含有鹽類，考慮到其對(duì)色譜系統(tǒng)有一定的損傷，因此不予采用；參考文獻(xiàn)[2]將流動(dòng)相調(diào)整為：乙腈-水(15∶85)。結(jié)果供試品中芍藥苷峰與雜質(zhì)峰可達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，保留時(shí)間適中(約15min)，與前后雜質(zhì)分離度分別為6.09、4.26，理論板數(shù)為12175(見(jiàn)圖11)。

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，確定本品的色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(15∶85)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 提取方法 超聲法：取丹芍康復(fù)丸(批號(hào)091101)適量，研細(xì)，混勻，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20ml，稱定重量，超聲處理(功率120W，頻率40kHz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。

回流法：取供試品按2.2.1 法操作，將超聲30分鐘改為回流30分鐘，其余同超聲法制備。

取上述兩種溶液，分別取10ul，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果如下(見(jiàn)表7)。

表7 不同提取方法的試驗(yàn)結(jié)果(n=2)

從表7可以看出，采用超聲法測(cè)定結(jié)果高于采用回流法，這是超聲萃取的效率高于傳統(tǒng)的加熱回流。

2.2.2 提取溶劑的選擇 為了獲得最優(yōu)提取溶劑，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)芍藥苷的特性，分別采用水、稀乙醇(50.0%)、甲醇作為溶劑進(jìn)行提取。取丹芍康復(fù)丸(批號(hào)091101)，照2.2.1法中超聲法，分別用水、稀乙醇(50.0%)、甲醇進(jìn)行提取制備供試品溶液，分別測(cè)定樣品中芍藥苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 不同溶劑試驗(yàn)結(jié)果

從表8可以看出甲醇的提取效率高于稀乙醇、水。這是由于芍藥苷更易溶于甲醇。

2.2.3 提取時(shí)間的選擇 為了獲得最優(yōu)提取時(shí)間，取丹芍康復(fù)丸(批號(hào)091101)3份，以甲醇為提取溶劑，按超聲法，分別超聲處理15分鐘，30分鐘，60分鐘，制成供試品溶液，分別測(cè)定芍藥苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 提取時(shí)間對(duì)芍藥苷含量的影響(n=2)

從表9可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品溶液中的芍藥苷濃度緩慢增加，到30分鐘左右達(dá)到峰值，隨后逐漸降低?？赡茉蚴浅?5分鐘時(shí)樣品中芍藥苷提取不完全。在超聲30min到達(dá)峰值后，繼續(xù)超聲提取，導(dǎo)致芍藥苷分解。因此選擇30分鐘作為本品提取時(shí)間。

綜上，丹芍康復(fù)丸中芍藥苷的最佳提取方法為：取本品適量，研細(xì)，混勻，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20ml，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率50kHz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥36小時(shí)的芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，備用。

2.4 陰性對(duì)照品溶液的制備 取廠家提供的陰性對(duì)照，相當(dāng)于供試品的量，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 儀器精密度 精密吸取濃度為64.8μg/ml的芍藥苷對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，按5項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定芍藥苷峰面積，結(jié)果表明，儀器精密度良好(見(jiàn)表10)。

2.5.2 準(zhǔn)確度 取同一批已知含量(批號(hào)091101，含量4.569mg/g)的供試品6份，每份取樣為供試品取量(0.5g)的50%，以當(dāng)前取樣含量的1∶1，分別精密加入芍藥苷對(duì)照品溶液(0.436mg/ml)5ml，按含量測(cè)定方法確定，計(jì)算芍藥苷回收率。結(jié)果平均回收率為98.9%，RSD=2.50%(見(jiàn)表11)。

表10 儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果

表11 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.5.3 精密度 取同一批供試品(批號(hào)091101)6份，按含量測(cè)定方法測(cè)定。結(jié)果重復(fù)性良好(見(jiàn)表12)。

表12 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.4 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10μl，分別注入液相色譜儀，按含量測(cè)定的方法測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液在主峰位置無(wú)干擾峰出現(xiàn)，因此認(rèn)為方法專屬(見(jiàn)圖12)。

2.5.5 線性考察 精密量取芍藥苷對(duì)照品溶液(0.292mg/ml)0.2、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1ml含5.84、29.2、58.4、87.6、146.0、292.0μg的梯度溶液。分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，按含量測(cè)定方法測(cè)定，以對(duì)照品的濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.216X+0.0761，r=0.9999。

結(jié)果表明，芍藥苷對(duì)照品濃度在5.84～292.0μg/ml之間與其峰面積呈良好的線性關(guān)系(見(jiàn)表13、圖13)。

2.5.6 耐用性 取同一份供試品溶液，自制備后，按含量測(cè)定方法，分別在0、2、4、6、8、24小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液自制備后24小時(shí)內(nèi)測(cè)定基本穩(wěn)定(見(jiàn)表14)。

2．5．7 供試品含量測(cè)定 取供試品六批，按含量測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表15。

表13 線性考察結(jié)果

表14 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表15 供試品含量測(cè)定

3 討論

丹芍康婦丸具有活血化瘀，調(diào)經(jīng)止痛的功效，對(duì)改善人工流產(chǎn)術(shù)后出血和疼痛有明顯效果。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇為提取劑，超聲30min提取丹芍康復(fù)丸中芍藥苷，采用乙腈-水(15∶85)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，對(duì)廣州博濟(jì)醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司6批丹芍康復(fù)丸樣品進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明所建立的方法簡(jiǎn)單，可靠，重現(xiàn)性好，為丹芍康復(fù)丸的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

[1]中國(guó)藥赤芍藥材藥典標(biāo)準(zhǔn).中國(guó)藥典(一部)[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：147.

[2]通心絡(luò)膠囊藥典標(biāo)準(zhǔn).中國(guó)藥典(一部)[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：1050.

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1007-8517(2014)12-0006-03

2014.03.25)