阿依甫汗·阿汗，吐爾干艾力·阿吉，邵英梅，溫 浩，哈麗婭 (新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽包蟲外科，新疆烏魯木齊 830000)

1型糖尿病是一種由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)、多種免疫機(jī)制共同參與的器官特異性自身免疫性疾?。?］，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未完全明了。多種免疫細(xì)胞參與1型糖尿病的發(fā)病過程，包括T淋巴細(xì)胞(Th2和Th1)。在此過程中，Th1/Th2平衡向左移動，抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)，使得胰島β細(xì)胞破壞。研究表明，細(xì)粒棘球蚴抗原B使Th1/Th2向Th2狀態(tài)偏移，導(dǎo)致Th1/Th2的平衡紊亂［2－4］。因此，本研究旨在用細(xì)粒棘球蚴抗原B干預(yù)BALB/C小鼠免疫狀態(tài)，觀察小鼠糖尿病患病情況，分析棘球蚴抗原B對BALB/C小鼠1型糖尿病有無拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物:6～8周齡雄性BALB/c小鼠(清潔級)，體重(23±2)g。購于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物中心，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物房內(nèi)(SPF級)，自由飲食。

1.2 主要試劑和耗材:小鼠IL－4、IFN－γ試劑盒:武漢博士德公司;鏈脲佐菌素(STZ):美國sigma公司;細(xì)粒棘球蚴抗原B:新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院包蟲病研究所;檸檬酸、檸檬酸鈉:武漢市瑞特化學(xué)用品有限公司;血糖儀:德國羅氏卓越型血糖儀;血糖試紙:德國羅氏公司卓越型血糖試紙。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組與處理

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組:將30例BALB/c小鼠，隨機(jī)分為A組:肌內(nèi)注射細(xì)粒棘球蚴抗原B加糖尿病成模組;B組:肌內(nèi)注射生理鹽水加糖尿病成模組;C組:正常對照組。每組各10只。購得小鼠后于動物房內(nèi)常規(guī)條件下飼養(yǎng)1周使其適應(yīng)環(huán)境，1周后A組給予濃度為0.54 mg/L的細(xì)粒棘球蚴抗原B，100 μg/10 g經(jīng)肌肉注射，連續(xù)5 d。同時B組給予相同劑量(100 μg/10 g)的生理鹽水經(jīng)肌肉注射，連續(xù)5 d，觀察2天(有無瘙癢、煩躁等)后，A組和 B組均給予小劑量 STZ 40 mg/(kg·d)，連續(xù)5 d腹腔內(nèi)注射，C組小鼠未給予任何處理。

1.3.2 指標(biāo)測定:開始注射STZ后第3天和第7天，測量全部小鼠的血糖、體重，并觀察每天飲水量、尿量等情況，血糖≥16.7 mmol/L且次日復(fù)測仍為此水平，提示1型糖尿病模型建成［5］，于用藥后1周、2周、3周測量所有成模小鼠的體重、血糖水平。成模3周后，摘眼球取血法，留取成模小鼠血液標(biāo)本，10 min離心分離血清，存于－70℃冰箱，以備以后使用，即用ELISA法檢測細(xì)胞因子。頸椎脫臼處死所有小鼠，分離胰腺組織，置于10%的中性甲醛緩沖液中固定24 h，常規(guī)脫水，透明及石蠟包埋，切片，蘇木素－伊紅染色，光鏡下觀察胰島炎，評價胰島淋巴細(xì)胞浸潤或胰島炎的嚴(yán)重程度。

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)動物體重變化:A組和B組小鼠初始、成模1周及成模2周時體重分別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但均輕于C組(P＜0.05)。而在成模后3周時，B組小鼠輕于A組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組小鼠體重變化( ± s，g)

表1 各組小鼠體重變化( ± s，g)

注:與A組相比，①P＜0.05;與 B組相比，②P＜0.05

組別 初始體重 成模后體重1周 2周 3周A組 24.13±1.45 21.28±2.98 21.71±2.84 21.82±2.82 B組 23.84±1.64 21.12±2.32 21.84±2.02 18.13±2.18①C組 24.21±1.56 26.18±2.29①②28.38±3.94①②30.60±4.61①②

2.2 各組實(shí)驗(yàn)動物血糖變化:在注射STZ成模1周、成模2周、成模3周時，A組與B組和C組比較血糖變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明B組血糖上升水平較A組高;B組和C組血糖之間有明顯差異(P＜0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血糖變化(x ± s，mmol/L)

2.3 實(shí)驗(yàn)動物血清免疫學(xué)指標(biāo)測定:在糖尿病模型建立后3周，A組小鼠血清IL－4含量高于B組和C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B組小鼠血清IFN－γ含量高于A組和C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 小鼠血清中IL－2和IL－10 ELISA檢測(x ± s，ng/ml)

2.4 實(shí)驗(yàn)動物胰腺組織的病理學(xué)變化:造模后3周，觀察小鼠胰腺及胰島組織的病理變化。B組小鼠胰島可見大量淋巴細(xì)胞浸潤，胰島細(xì)胞數(shù)量減少，并可見胰島結(jié)構(gòu)被破壞;A組小鼠胰島雖也見淋巴細(xì)胞浸潤，但其結(jié)構(gòu)大多保持完整，多為圓形或橢圓形的細(xì)胞團(tuán)，數(shù)量多，均勻分布，分散于胰腺腺泡之間，胰島界限清楚，未見胰島內(nèi)部有大量淋巴細(xì)胞浸潤。C組小鼠胰島未見淋巴細(xì)胞浸潤。

3 討論

糖尿病已經(jīng)成為威脅我國人群健康的主要疾病之一［6］。其中，1型糖尿病，占糖尿病的10% ～20%，是一種病因尚待闡明的自身免疫疾病?；颊叨酁榍嗌倌辏l(fā)病時年齡不到20歲。1型糖尿病主要表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞明顯減少，血中胰島素含量明顯降低，易發(fā)生酮血癥甚至昏迷，治療依賴胰島素。1型糖尿病早期可見胰島炎，胰島內(nèi)及其周圍有大量淋巴細(xì)胞浸潤。胰島細(xì)胞逐漸被破壞、消失，進(jìn)而導(dǎo)致胰島變小，數(shù)目減少，甚至胰島纖維化。研究證實(shí)，在1型糖尿病的發(fā)病過程中，Th1亞群主要介導(dǎo)致病性的免疫反應(yīng)，而Th2亞群主要介導(dǎo)保護(hù)性的免疫反應(yīng)。

多次低劑量STZ(MLD－STZ)注射誘導(dǎo)的小鼠糖尿病模型最早是在1976年建立的［7－8］。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)給易感小鼠小劑量連續(xù)5次腹腔注射STZ能激活小鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞，在1周后即可產(chǎn)生與人類1型糖尿病完全相似的伴有胰島炎性反應(yīng)的病理改變，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞大量的破壞以及糖尿病的發(fā)生。β細(xì)胞損傷的同時伴有明顯的胰島炎發(fā)生表明STZ的致糖尿病的作用可能是通過激發(fā)了免疫應(yīng)答來介導(dǎo)的，自身免疫機(jī)制可能在誘導(dǎo)該模型中起到重要的作用［8］。因此，MLD－STZ方法誘導(dǎo)的模型可作為一種很好的1型糖尿病的研究模型。

Rigano等研究發(fā)現(xiàn)用B抗原刺激后［9］，患者的外周血單核細(xì)胞分泌IL－4及IL－13，而非IL－12，可見B抗原可使外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生Th1/Th2細(xì)胞因子比值改變，使宿主的免疫傾向于病理免疫相關(guān)的Th2反應(yīng)，在進(jìn)展期的病例中更為明顯，說明在早期的免疫應(yīng)答過程中，蟲體可通過分泌B抗原抑制多型核細(xì)胞的趨化來逃避宿主的免疫攻擊。因此，可認(rèn)為細(xì)粒棘球蚴病，作為一種寄生蟲病，對人體亦有有利的一面。寄生蟲感染通過調(diào)節(jié)免疫可改變某些自身免疫性疾病的免疫反應(yīng)形式，某種程度上可起到治療的作用。那么是否能利用細(xì)粒棘球蚴B抗原的免疫偏移機(jī)制來調(diào)節(jié)1型糖尿病體內(nèi)的Th1/Th2反應(yīng)之間的失衡，有待探討。

本實(shí)驗(yàn)顯示，各組小鼠在給予STZ連續(xù)腹腔內(nèi)注射后血糖水平均升高，但肌內(nèi)注射生理鹽水組血糖水平，與肌內(nèi)注射細(xì)粒棘球蚴抗原B組相比，上升更明顯，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示細(xì)粒棘球蚴抗原B組血糖上升緩慢，表明細(xì)粒棘球蚴抗原B對小鼠糖尿病早期具有拮抗作用。監(jiān)測小鼠體重發(fā)現(xiàn)，各注射藥物組體重在成模前、成模后1周及成模后2周無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在第3周時，肌內(nèi)注射細(xì)粒棘球蚴抗原B組小鼠重于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明細(xì)粒棘球蚴抗原B對糖尿病小鼠體重有保護(hù)作用。國內(nèi)外多項(xiàng)研究顯示［10－12］，曼氏或日本血吸蟲感染無論對MLD－STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病模型還是非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠均具有很好的拮抗和保護(hù)作用。在本研究中，注射生理鹽水的糖尿病模型組可見較多的胰島有淋巴細(xì)胞浸潤，而在細(xì)粒棘球蚴抗原B組少數(shù)胰島可見淋巴細(xì)胞浸潤。胰島炎是自身免疫性1型糖尿病小鼠最明顯的病理損傷，胰島炎的減輕在一定程度上反映了免疫反應(yīng)受到抑制。根據(jù)上述結(jié)果，可認(rèn)為細(xì)粒棘球蚴抗原B對小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性1型糖尿病具有明顯的保護(hù)作用和拮抗作用。

本研究結(jié)果顯示，在細(xì)粒棘球蚴抗原B組，由于Th2細(xì)胞分泌的IL－4水平顯著升高，拮抗Th1細(xì)胞釋放的致炎性細(xì)胞因子IFN－γ等的作用，減輕了胰島炎性損害，胰島細(xì)胞得到保護(hù)。而在糖尿病模型對照組，由于浸潤的Th1細(xì)胞釋放的致炎性細(xì)胞因子的作用，分泌胰島素的胰島β細(xì)胞被大量破壞，最終發(fā)展為糖尿病。

1型糖尿病發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，Th1、Th2免疫調(diào)節(jié)只是其中的一個環(huán)節(jié)，尚有更多的未知因素有待進(jìn)一步了解。而包蟲病作為新疆地區(qū)的多發(fā)病和特色病，因此研究細(xì)粒棘球蚴抗原B對1型糖尿病的保護(hù)作用以及機(jī)理，不僅在1型糖尿病的防治上具有重要意義，而且可以為利用細(xì)粒棘球蚴B抗原對1型糖尿病進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療提供新的理論基礎(chǔ)。

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