張續(xù)乾 來(lái)培培 董 魁 方維麗 李海東 劉文天*

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化科1(300052) 天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種慢性非特異性結(jié)直腸炎癥病變。近15年來(lái)，UC發(fā)病率在我國(guó)呈持續(xù)上升趨勢(shì)[1]。然而，目前UC的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，已成為一個(gè)亟待解決的難題。已有研究證實(shí)，炎癥性腸病(IBD)患者血清促炎細(xì)胞因子水平較正常人群顯著升高，能導(dǎo)致不同程度的腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)破壞[2]。本研究通過(guò)檢測(cè)UC患者結(jié)腸黏膜促炎細(xì)胞因子干擾素-γ(IFN-γ)和緊密連接蛋白o(hù)ccludin、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1， ZO-1)的表達(dá)情況以及其間的相關(guān)性，為明確UC的發(fā)病機(jī)制提供線索。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

納入2011年1月-2011年7月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院就診的UC患者。UC診斷標(biāo)準(zhǔn)參考“對(duì)我國(guó)炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見(jiàn)”[3]。選取20名同時(shí)期健康體檢者(結(jié)腸鏡檢查未見(jiàn)結(jié)直腸黏膜病變)作為正常對(duì)照組。UC組患者入組前2周內(nèi)未服用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑，正常對(duì)照組近1個(gè)月內(nèi)無(wú)胃腸道疾病以及服用相關(guān)藥物史。所有受檢者于結(jié)腸鏡下取結(jié)腸黏膜組織標(biāo)本。研究方案經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組者均簽屬知情同意書(shū)。

二、研究方法

1. 免疫組化染色檢測(cè)結(jié)腸黏膜組織IFN-γ、occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)和分布：結(jié)腸黏膜組織經(jīng)石蠟包埋后，4 μm連續(xù)切片、烤片，常規(guī)二甲苯脫蠟，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，高溫高壓抗原修復(fù)，非免疫血清封閉。分別加入兔抗人IFN-γ多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、兔抗人occludin、ZO-1多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)(滴度均為1∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min，加入SABC試劑(武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，樹(shù)膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判斷：光學(xué)顯微鏡下出現(xiàn)黃色顆粒狀染色的細(xì)胞判定為免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片在高倍鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)視野，每組計(jì)數(shù)不少于1 000個(gè)細(xì)胞，參照Shimizu等[4]采用的方法，依據(jù)染色陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分率和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：0分，<5%；1分，5%～25%；2分，25%～50%；3分，50%～75%；4分，>75%。陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：0分，無(wú)染色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色?？偡譃殛?yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分之和：0分，(-)；1～2分，(+)；3～5 分，(++)；6～7分，(+++)。

2. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)腸黏膜occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)：①取結(jié)腸黏膜組織，采用DNA/RNA共提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取總RNA。②逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA：采用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反應(yīng)體系(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，引物由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。③實(shí)時(shí)熒光定量PCR：采用TransStart Green qPCR SuperMix反應(yīng)體系(北京全式金生物技術(shù)有限公司)和ABI 7500 Real-time PCR儀，引物由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。Occludin上游引物：5’-GGG ACA AGG AAC ACA TTT ATG AT-3’，下游引物：5’-TGG ATT TAT AGG AAG ACT CTG GAT-3’；ZO-1上游引物：5’-GCG GTC AGA GCC TTC TGA TC-3’，下游引物：5’-CAT GCT TTA CAG GAG TTG AGA CAG-3’。所得結(jié)果以2-△△Ct法分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

共納入40例UC患者，其中男23例，女17例，平均年齡(46.80±16.76)歲，UC緩解期12例，活動(dòng)期28例，其中輕度活動(dòng)期9例，中度活動(dòng)期13例，重度活動(dòng)期6例。正常對(duì)照組20名，其中男12名，女8名，平均年齡(42.60±8.13)歲。兩組間性別構(gòu)成、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、結(jié)腸黏膜IFN-γ蛋白表達(dá)情況

IFN-γ染色陽(yáng)性物質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等，多集中于靠近黏膜肌層的黏膜固有層內(nèi)，黏膜上皮細(xì)胞有少量表達(dá)。UC組結(jié)腸黏膜上皮和間質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)明顯INF-γ表達(dá)，而正常對(duì)照組僅有少量或無(wú)IFN-γ表達(dá)(圖1)。UC組IFN-γ蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著升高(χ2=20.470,P=0.000)，且活動(dòng)期顯著高于緩解期(χ2=18.936,P=0.004)(表1)。進(jìn)一步按UC不同疾病活動(dòng)期進(jìn)行比較，UC重度活動(dòng)期IFN-γ免疫組化染色評(píng)分均數(shù)較輕、中度活動(dòng)期和緩解期顯著升高(F=5.977,P=0.002)，輕、中度活動(dòng)期和緩解期組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.075,P=0.121)(表2)。

三、結(jié)腸黏膜occludin、ZO-1蛋白表達(dá)情況

Occludin、ZO-1染色陽(yáng)性物質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)，主要表達(dá)于腸上皮細(xì)胞。UC組結(jié)腸黏膜occludin、ZO-1蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低(χ2=7.790，P=0.020；χ2=17.691，P=0.000)(圖2、表3)，UC活動(dòng)期與緩解期組間、不同疾病活動(dòng)期組間occludin、ZO-1蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.945，P=0.551；χ2=5.291，P=0.507)(表3、表4)。

四、結(jié)腸黏膜occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)情況

UC組結(jié)腸黏膜occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組(Z=3.599，P=0.000；Z=3.826，P=0.000)(表5)，UC不同疾病活動(dòng)期組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.928，P=0.437；F=0.435，P=0.729)(表6)。

A：UC組結(jié)腸黏膜上皮和間質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)明顯IFN-γ表達(dá)；B：正常對(duì)照組結(jié)腸黏膜僅有少量或無(wú)IFN-γ表達(dá)

表1 正常對(duì)照組與UC組結(jié)腸黏膜IFN-γ蛋白表達(dá)比較 n(%)

表2 UC不同疾病活動(dòng)期IFN-γ蛋白表達(dá)比較

表3 正常對(duì)照組與UC組結(jié)腸黏膜occludin、ZO-1蛋白表達(dá)比較n(%)

表4 UC不同疾病活動(dòng)期occludin、ZO-1蛋白表達(dá)比較n(%)

表5 正常對(duì)照組與UC組結(jié)腸黏膜occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)比較

表6 UC不同疾病活動(dòng)期occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)比較

五、IFN-γ與occludin、ZO-1的相關(guān)性分析

Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，IFN-γ蛋白表達(dá)與occludin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.794，P=0.000)，與ZO-1蛋白表達(dá)亦呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.820，P=0.000)。

討 論

UC是消化系統(tǒng)常見(jiàn)疾病和慢性腹瀉的主要病因，主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、黏液膿血便，病情輕重不一，且可發(fā)生嚴(yán)重的局部和遠(yuǎn)處并發(fā)癥，治愈難度相當(dāng)大，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。

研究證實(shí)，IFN-γ作為一種重要的促炎因子，單獨(dú)或與其他促炎因子共同作用時(shí)，可引起腸黏膜屏障損傷，進(jìn)而導(dǎo)致IBD發(fā)生[5-7]。Gassler等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，在IBD活動(dòng)性炎癥組織中，緊密連接蛋白及其mRNA表達(dá)均顯著下降。對(duì)腸黏膜屏障功能相關(guān)基因的研究發(fā)現(xiàn)，UC腸黏膜屏障功能相關(guān)基因表達(dá)異常導(dǎo)致其編碼蛋白表達(dá)下降，可能在UC發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9-10]，緊密連接蛋白相關(guān)基因表達(dá)異?？赏ㄟ^(guò)影響連接復(fù)合體構(gòu)成、調(diào)控黏蛋白、水通道蛋白表達(dá)而影響腸黏膜通透性[11-14]。本研究檢測(cè)了UC患者的結(jié)腸黏膜促炎細(xì)胞因子IFN-γ和緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸黏膜中的IFN-γ蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著升高，進(jìn)一步作不同疾病活動(dòng)期組間比較，重度活動(dòng)期UC患者IFN-γ蛋白表達(dá)顯著高于輕、中度活動(dòng)期和緩解期患者，但輕、中度活動(dòng)期和緩解期患者間無(wú)明顯差異，表明IFN-γ與UC的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，與疾病活動(dòng)度之間亦存在一定相關(guān)性。Occludin、ZO-1 蛋白及其mRNA在UC組中的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低，但在不同疾病活動(dòng)期組間無(wú)明顯差異，表明occludin、ZO-1與UC的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，但與疾病活動(dòng)度可能無(wú)關(guān)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)IFN-γ蛋白表達(dá)與occludin、ZO-1蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果提示，IFN-γ可能通過(guò)下調(diào)occludin、ZO-1表達(dá)，引起腸黏膜屏障功能損害，導(dǎo)致腸黏膜通透性增加，從而參與UC的發(fā)生。Utech等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，以IFN-γ處理T84腸上皮細(xì)胞36 h，可促進(jìn)Rho相關(guān)激酶(ROCK)編碼基因表達(dá)，進(jìn)而激活Rho，導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈激酶磷酸化，使肌球蛋白Ⅱ活化，引起頂層質(zhì)膜空泡化改變，最終導(dǎo)致緊密連接蛋白移位、降解。陳紅旗等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，IL-10敲除小鼠存在腸屏障功能障礙，表現(xiàn)為促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、IFN-γ濃度升高、腸上皮細(xì)胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)破壞、腸黏膜通透性增加，而給予益生菌干預(yù)能減輕腸道炎癥，降低TNF-α、IFN-γ濃度和腸黏膜通透性，促進(jìn)緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1表達(dá)。上述研究亦支持IFN-γ可能通過(guò)參與下調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)而導(dǎo)致UC發(fā)生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸黏膜IFN-γ表達(dá)增高，同時(shí)緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1表達(dá)降低，提示IFN-γ可能參與下調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)，在UC發(fā)病中起有重要作用。然而，目前對(duì)IFN-γ通過(guò)何種途徑調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達(dá)及其相關(guān)分子機(jī)制尚無(wú)定論，需進(jìn)一步深入研究，以闡明UC的發(fā)病機(jī)制，為其臨床治療提供理論依據(jù)。

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