錢雪芬 張健鋒 俞智華 鞠少卿 毛振彪#

南通大學附屬醫(yī)院消化內科1(226000) 外科綜合實驗室2

胃癌是一種嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤，在全球男女性癌癥死因中分居第三和第五位，研究胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，提高胃癌患者的早期診斷率和生存率已成為目前臨床研究工作的重點。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮細胞失去上皮特征、同時獲得間質特征的過程，這一過程與上皮性惡性腫瘤的侵襲、轉移密切相關[1-4]。尾型同源盒轉錄因子2(caudal-type homeobox transcription factor 2, CDX2)是一種腸特異性核轉錄因子，在維持正常腸上皮細胞分化和增殖調控中起重要作用。研究[5-7]發(fā)現(xiàn)CDX2過表達能抑制胃癌細胞生長增殖，誘導細胞凋亡，并降低其遷移、侵襲能力，提示CDX2基因在胃癌中起抑癌基因作用。CDX2抑制胃癌的作用是否與影響EMT有關，目前尚不清楚。本研究旨在探討CDX2對胃癌細胞遷移、侵襲能力的影響與EMT的關系，為揭示胃癌侵襲、轉移的分子機制提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

人胃癌細胞株SGC-7901、MKN-45、AGS購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。pGPU6/GFP/Neo-CDX2-shRNA質粒和無關序列(陰性對照)shRNA質粒由上海吉瑪制藥技術有限公司構建，pEGFP-N1-CDX2真核表達質粒和空質粒由南通大學附屬醫(yī)院外科綜合實驗室提供。Lipofect-amine?2000 轉染試劑、TRIzol?試劑、RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche Applied Science)，Transwell小室(EMD Millipore)，兔抗人上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)多克隆抗體(Proteintech Group, Inc.)。

二、方法

1. 細胞培養(yǎng)：3株人胃癌細胞使用含10% FBS和100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

2. 質粒轉染：轉染前24 h于6孔板中每孔接種5×105個細胞，加入2 mL無抗完全培養(yǎng)基，細胞匯合度達到70%～80%時，分別以250 μL無血清培養(yǎng)基稀釋4.0 μg質粒DNA和10 μL Lipofectamine?2000轉染試劑，室溫靜置5 min。混合兩種稀釋液，室溫靜置20～30 min，加入至6孔板中，補充無血清培養(yǎng)基至每孔2 mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染后4～6 h更換無抗完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

3. 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)：取對數(shù)生長期細胞或各組轉染后48 h細胞，以TRIzol?試劑提取總RNA，以RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒逆轉錄合成cDNA，反應條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，逆轉錄產(chǎn)物-20 ℃保存，待行qRT-PCR。Primer Primier 5.0軟件設計CDX2和內參照β-actin的qRT-PCR引物。CDX2引物序列：F 5’-CGC CGC AGA ACT TCG TCA G-3’，R 5’-CGT AGC CAT TCC AGT CCT CCC-3’；β-actin引物序列：F 5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，R 5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’。qRT-PCR反應體系內含F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master(Rox)10 μL、cDNA 3 μL、上、下游引物各0.6 μL(10 μmol/L)，以RNase-free H2O補足至20 μL。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。2-△△Ct法計算CDX2 mRNA相對表達量。

4.劃痕試驗：取各組轉染后24 h細胞，于6孔板中每孔接種5×105個，無抗完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，以無菌200 μL槍頭在單細胞層上劃痕，PBS洗去脫壁細胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于劃痕后不同時間點在倒置顯微鏡下每孔選取4個視野拍照，記錄劃痕修復情況。劃痕修復率=(0 h劃痕寬度-某時點劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。

5. 細胞侵襲實驗：于Transwell小室上室面涂布30 μL Matrigel基底膜基質膠，37 ℃放置1 h。取各組轉染后48 h細胞，無血清培養(yǎng)基重懸，以1×105/孔接種于Transwell小室上室中(100 μL)，下室中加入含20% FBS的培養(yǎng)基600 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，PBS清洗，以棉簽輕輕拭去上室濾膜內側面貼壁細胞， 4%多聚甲醛溶液固定濾膜10 min，結晶紫染色15 min，PBS清洗，待上室自然風干，光學顯微鏡下計數(shù)濾膜背面侵襲細胞，每張濾膜隨機計數(shù)中央部分和周圍部分共10個低倍視野(×100)，結果取均值。

6. 蛋白質印跡法：取各組轉染后48 h細胞提取總蛋白，測定蛋白含量，-80 ℃保存。SDS-PAGE凝膠電泳：上樣，恒壓調節(jié)80 V 30 min后120 V電泳60 min，恒流轉膜至PVDF膜300 mA 120 min，5%脫脂牛奶室溫搖床封閉2 h，將經(jīng)封閉液稀釋的一抗(兔抗人E-cadherin、vimentin多克隆抗體)稀釋液平鋪在封閉后的PVDF膜上，4 ℃孵育過夜，洗膜，加入HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，洗膜，ECL顯影，圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶，計算目的蛋白相對表達量。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、胃癌細胞CDX2 mRNA表達

qRT-PCR檢測顯示，AGS細胞中CDX2 mRNA高表達，SGC-7901和MKN-45細胞中CDX2 mRNA低表達，相對表達量分別為365.369±78.160、1.000±0.143和7.713±1.517(AGS對SGC-7901和MKN-45，P均<0.05)。

二、質粒轉染效率

予CDX2低表達的MKN-45細胞轉染CDX2真核表達質?；蚩召|粒，予CDX2高表達的AGS細胞轉染CDX2-shRNA或陰性對照shRNA，轉染后48 h以qRT-PCR檢測CDX2 mRNA表達以評估轉染效率。結果顯示，與未轉染或轉染空質粒相比，MKN-45細胞轉染CDX2過表達質粒pEGFP-N1-CDX2后，細胞中的CDX2 mRNA相對表達量顯著增高(3 064.000±278.160對1.000±0.143和7.253±1.517，P均<0.05)；與未轉染或轉染陰性對照shRNA相比，AGS細胞轉染CDX2干擾質粒pGPU6/GFP/Neo-CDX2-shRNA后，細胞中的CDX2 mRNA相對表達量顯著降低(1.000±0.240對11.567±1.460 和12.579±0.980，P均<0.05)。

三、胃癌細胞遷移能力

劃痕試驗顯示，與同時點未轉染或轉染空質粒相比，過表達CDX2的MKN-45細胞48 h和72 h時劃痕修復率明顯降低，組間差異有統(tǒng)計學意義，表明細胞遷移能力降低；與同時點未轉染或轉染陰性對照shRNA相比，沉默CDX2表達的AGS細胞12 h、24 h和36 h時劃痕修復率均明顯增高，組間差異有統(tǒng)計學意義，表明細胞遷移能力增強。轉染空質粒的MKN-45細胞和轉染陰性對照shRNA的AGS細胞與相應未轉染細胞相比，各時點劃痕修復率均無明顯差異(圖1)。

四、胃癌細胞侵襲能力

細胞侵襲實驗顯示，與未轉染或轉染空質粒相比，過表達CDX2的MKN-45細胞穿膜細胞數(shù)顯著減少，表明細胞侵襲能力降低；與未轉染或轉染陰性對照shRNA相比，沉默CDX2表達的AGS細胞穿膜細胞數(shù)顯著增多， 表明細胞侵襲能力增強。轉染空質粒的MKN-45細胞和轉染陰性對照shRNA的AGS細胞與相應未轉染細胞相比，穿膜細胞數(shù)均無明顯差異(圖2)。

EV：空質粒(empty vector)；NC：陰性對照(negative control)

五、胃癌細胞EMT標記物表達

蛋白質印跡法檢測顯示，與轉染空質粒相比，過表達CDX2的MKN-45細胞中上皮標記物E-cadherin表達顯著增高，間質標記物vimentin表達顯著降低，表明胃癌細胞發(fā)生EMT逆轉；與轉染陰性對照shRNA相比，沉默CDX2表達的AGS細胞中E-cadherin表達顯著降低，vimentin表達顯著增高，表明胃癌細胞發(fā)生EMT(圖3)。

討 論

EMT是上皮細胞在特定條件下失去極性，向間質細胞轉化的現(xiàn)象，是多細胞生物胚胎發(fā)育中的一個基本過程[3-4]，可使在特定部位產(chǎn)生的上皮細胞從上皮組織中分離并遷移至其他位置，是正常發(fā)育、傷口愈合、組織重建等的基礎。目前，大量研究證實EMT參與了惡性腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展， 是腫瘤侵襲、轉移的一個重要過程[1-4]，EMT概念的提出使人們對腫瘤侵襲、轉移的發(fā)生機制有了更深刻的理解。EMT發(fā)生過程復雜，包括細胞間黏附力喪失、細胞外基質破壞、細胞骨架重建等，涉及多個信號途徑和多種分子機制。在EMT過程中，上皮標記物E-cadherin等表達降低，而間質標記物vimentin、fibronectin等表達增高，因此本研究選擇檢測E-cadherin、vimentin表達水平以反映胃癌細胞的EMT狀態(tài)。

A、B：各組穿膜細胞(×100)；C、D：各組每低倍視野穿膜細胞數(shù)比較(*P<0.05)

A：各組EMT標記物表達蛋白質印跡法電泳圖；B：各組EMT標記物相對表達量比較(*P<0.05)

核轉錄因子CDX2在腸道發(fā)育和分化過程中起關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)CDX2在結腸癌中發(fā)揮抑癌基因功能，其表達下調或缺失可導致染色體不穩(wěn)定，在結腸腫瘤發(fā)生中起關鍵作用：結腸癌組織CDX2表達較臨近正常組織顯著降低；雜合子Apc+/Delta716腺瘤性息肉病小鼠如合并CDX2+/-，結腸息肉數(shù)量可增加約6倍[8]；經(jīng)致癌劑氧化偶氮甲烷處理的CDX2+/-小鼠發(fā)生遠端結腸侵襲性腺癌，野生型小鼠則未見腫瘤發(fā)生，CDX2+/-小鼠結腸上皮對放療誘導的細胞凋亡的敏感性亦低于野生型小鼠[9]。最近研究[10]證實，結腸癌細胞內受體酪氨酸激酶信號通路異常激活，誘導CDX2表達下調并促進EMT，導致結腸癌侵襲、轉移。

CDX2是一種腸上皮細胞特異性核轉錄因子，正常胃黏膜組織不表達CDX2，而腸化生、異型增生和胃癌組織中存在CDX2異位表達[11]。近年研究顯示CDX2在胃癌中亦發(fā)揮抑癌基因功能。體外實驗和裸鼠原位移植瘤模型均證實過表達CDX2可明顯抑制胃癌細胞生長增殖[5-7]，體外實驗中，恢復胃癌細胞的CDX2表達還可降低其遷移、侵襲能力[5]。本研究劃痕試驗和細胞侵襲實驗顯示，予CDX2基因低表達的人胃癌細胞株MKN-45過表達CDX2能顯著抑制其遷移、侵襲能力，而沉默CDX2基因高表達的人胃癌細胞株AGS中的CDX2表達后，其遷移、侵襲能力顯著增強，表明CDX2表達水平改變可影響胃癌細胞的遷移、侵襲能力，從而參與胃癌的侵襲、轉移過程。蛋白質印跡法檢測顯示，過表達CDX2可上調MKN-45細胞的E-cadherin表達，下調vimentin表達，而沉默CDX2表達的作用與之相反，由此推測CDX2可能參與了胃癌細胞EMT的調控，其表達缺失可促進EMT，過表達時則能逆轉EMT，從而抑制胃癌細胞遷移、侵襲。但CDX2具體通過何種途徑調控EMT，進而參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，目前尚無明確結論，其間的分子機制有待深入研究。CDX2與EMT關系的研究可能為胃癌的診斷、治療提供新的診斷標記物和治療靶點。

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