馬有智，于媛媛，舒妙安，胡 斌，徐海圣*

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.湖州市楊家埠街道農(nóng)業(yè)公共服務(wù)中心，浙江湖州 313005）

嗜水氣單胞菌生物被膜形成突變株的篩選及其特性

馬有智1，于媛媛1，舒妙安1，胡 斌2，徐海圣1*

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.湖州市楊家埠街道農(nóng)業(yè)公共服務(wù)中心，浙江湖州 313005）

為研究調(diào)控基因?qū)κ人畾鈫伟锉荒さ男纬蓹C(jī)制，本研究利用二親本結(jié)合轉(zhuǎn)座的方法，將攜帶mTn5gusA-pgfp21的載體pFAJ1819導(dǎo)入嗜水氣單胞菌野生株AH7中進(jìn)行轉(zhuǎn)座突變。通過(guò)對(duì)153株突變株的生物被膜測(cè)定，篩選出形成被膜能力較高的AHΔ82和形成被膜能力較低的AHΔ148。掃描電鏡觀察顯示AHΔ82生物被膜最致密，其次是AH7，AHΔ148較疏松。SDS-PAGE電泳表明，與AH7相比，兩個(gè)突變株在25 ku和35 ku之間缺少一條帶，AHΔ82比野生株多3條蛋白條帶。毒力測(cè)定表明3株細(xì)菌的毒力強(qiáng)度為：AH7>AHΔ148>AHΔ82，突變株毒力降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Tn5轉(zhuǎn)座子的插入突變影響細(xì)菌生物被膜的形成和毒力。

嗜水氣單胞菌；生物被膜；Tn 5；突變株

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila）為有鞭毛、無(wú)莢膜的革蘭氏陰性短桿菌，是廣泛存在于水生環(huán)境中的一種常見(jiàn)條件致病菌，可以引起魚(yú)類、蛙類等水生動(dòng)物的疾病[1]。生物被膜(Biofilms，BF）是細(xì)菌為適應(yīng)生存環(huán)境，在生長(zhǎng)過(guò)程中不可逆地粘附于固體表面形成的具有一定結(jié)構(gòu)的微生物群體，其外包裹了一層自分泌的胞外多糖類基質(zhì)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，A.hydrophila在水生環(huán)境中能夠形成BF，進(jìn)而在水體中增殖。BF的形成能夠增強(qiáng)細(xì)菌的抗藥性，還能使細(xì)菌逃避機(jī)體的免疫防御反應(yīng)，并且在細(xì)菌的感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與細(xì)菌毒力和持續(xù)感染密切相關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)利用mTn5轉(zhuǎn)座子進(jìn)行轉(zhuǎn)座突變，并篩選A.hydrophilaBF形成突變株，利用掃描電鏡觀察了突變株BF的結(jié)構(gòu)特征和形成過(guò)程，探討了A.hydrophila毒力與BF的關(guān)系，為深入研究A.hydrophila的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件E.coilS17-1λpir(Smr,recA,thi,pro,hsdR M+RP4:2-Tc:Mu:Km:Tn7,λpir），含有質(zhì)粒pFAJ1819(AprKmr，mTn5gusA-pgfp21），由廣西大學(xué)分子遺傳研究所提供。A.hydrophilaAH7菌株由本實(shí)驗(yàn)室自患病棘胸蛙肝臟分離鑒定；AH7菌株及其突變株在腦心浸出液(BHI）培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)24 h，E.coil在37℃培養(yǎng)16 h。所用抗生素的終濃度分別為氨芐青霉素(Ap）50 μg/mL、卡那霉素(Km）50 μg/mL、萘啶酮酸(Nal）50 μg/mL。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用斑馬魚(yú)購(gòu)自杭州花鳥(niǎo)市場(chǎng)，采用充分曝氣的清水飼養(yǎng)。

1.3 菌株A H 7突變體的制備 參照文獻(xiàn)[4]的方法，通過(guò)雙親本結(jié)合的方法將攜帶mTn5gusA-pgfp21的載體 pFAJ1819導(dǎo)入 AH7中。將E.coilS17-1λpir作為供體菌，AH7菌株作為受體菌。以0.0l mol/L MgSO4溶液將供體菌和受體菌分別洗滌2次后，按照1∶3的比例混勻，0.45 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，取下濾膜置于BHI平板中央，于37℃培養(yǎng)36 h。用0.01 mol/L的MgSO4溶液將濾膜上生長(zhǎng)的菌苔洗下，適當(dāng)比例稀釋后涂布于含有Nal和Km的BHI平板上進(jìn)行選擇培養(yǎng)。

1.4 A H 7突變株的篩選和鑒定 挑取在Nal和Km抗性選擇平板上生長(zhǎng)的細(xì)菌克隆，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA作為PCR反應(yīng)模板。通過(guò)PCR擴(kuò)增mTn5gusA-pgfp21中的gusA基因和gfp基因來(lái)鑒定突變株，擴(kuò)增引物分別為：PgusA1：5'-GGTACCTGACTAGCTAAGGAGGAGT-3'，PgusA2：5'-ACCGTTGATTCATTGTTTGCCT-3'；Pgfp1：5'-TTGGTACCATGGCTAGCAAAGGAGAAG-3'，Pgfp2：5'-TAGGGCCCTTATTTGTAGAGCTCATCC-3'，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.5 突變株B F測(cè)定和粘附程度的測(cè)量 體外BF形成測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[5]的微孔板法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。每株細(xì)菌設(shè)8個(gè)重復(fù)，以不含細(xì)菌的培養(yǎng)液為空白對(duì)照。

依據(jù)臨界OD570nm(ODc）即空白孔的平均OD570nm值(X）加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD）作為判斷BF與接觸表面粘附的牢固程度：OD≤ODc為不粘附(0），ODc40Dc 為強(qiáng)粘附(+++）[6]。

1.6 生物被膜的掃描電鏡觀察 將細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)液按1∶20稀釋轉(zhuǎn)接到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各孔中垂直放置無(wú)菌蓋玻片，28℃分別培養(yǎng)6 h、24 h、72 h后，取出蓋玻片，制片觀察。

1.7 S D S-P A G E檢測(cè) 將AH7及突變株在BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，調(diào)整OD600nm至1.8，離心收集菌體，制備全細(xì)胞蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.8 半數(shù)致死量(L D50）測(cè)定 將篩選和鑒定的突變體于28℃過(guò)夜培養(yǎng)，取1 mL菌液離心收集菌體，PBS洗3次，平板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)菌濃度為107cfu/mL，并進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋。選取不同的稀釋度腹腔接種經(jīng)MS-222麻醉的斑馬魚(yú)(10 μL/尾），每組接種20尾。對(duì)照組注射等量PBS。水溫29℃～30℃分組飼養(yǎng)，觀察斑馬魚(yú)的死亡情況，連續(xù)觀察5 d，計(jì)算LD50值。

1.9 最小抑菌濃度(MI C）的測(cè)定 選用四環(huán)素、紅霉素、鏈霉素、氯霉素、恩諾沙星和環(huán)丙沙星等6種藥物，按照NCCLS(1999）《抗微生物藥物敏感試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》，采用96孔板二倍稀釋法，測(cè)定其MIC值。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析 生物被膜OD570nm值數(shù)據(jù)以X±SD表示，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 突變體的篩選與鑒定 對(duì)153個(gè)菌株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示有147個(gè)菌株擴(kuò)增出約1.9 kb和750 bp的片段，表明這些菌株已發(fā)生轉(zhuǎn)座突變。其中野生株 AH7與生物被膜突變株 AHΔ82和AHΔ148的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 突變株染色體DNA中g(shù)usA與gfp基因的檢測(cè)Fig.1 Detection ofgusAandgfpgene inserted in chromosomal DNA of mutants by PCR

2.2 突變株B F的測(cè)定 對(duì)已鑒定的147個(gè)突變株和野生株進(jìn)行成膜能力測(cè)定，分別經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)顯示，與野生株AH7相比，大多數(shù)菌株成膜能力降低，少部分成膜能力增強(qiáng)。選取在BF測(cè)定試驗(yàn)中分別處于較高水平的AHΔ82和較低水平AHΔ148兩株突變株作為進(jìn)一步研究對(duì)象，這兩株突變株的BF形成能力與野生株AH7均有極顯著差異(p<0.01）(表 1）。

表1 野生株與突變株BF形成量的比較Table 1 Comparing biomass of the biofilm formation between wild type and mutant types(p<0.01）

2.3 B F的掃描電鏡觀察 分別將AH7及其突變株AHΔ82和AHΔ148進(jìn)行不同時(shí)間培養(yǎng)后，用掃描電鏡觀察BF的結(jié)構(gòu)特征和形成過(guò)程(圖2）。培養(yǎng)6 h時(shí)顯示，與AH7相比較，突變株AHΔ82形成的BF較為致密，而突變株AHΔ148形成的BF較稀疏；培養(yǎng)至24 h時(shí)，AH7及突變株BF中細(xì)菌數(shù)均減少，結(jié)構(gòu)變疏松,細(xì)菌呈單層分布；當(dāng)培養(yǎng)至72 h時(shí)，AH7生物被膜成片粘連，無(wú)明顯的菌體，而突變株AHΔ82和AHΔ148菌體尚清晰。

2.4 S D S-P A G E檢測(cè) 對(duì)野生株AH7及其突變株AHΔ82、AHΔ148的等量的全菌裂解物進(jìn)行 SDSPAGE電泳檢測(cè)。與野生株AH7相比，兩個(gè)突變株在25 ku和35 ku之間均缺少一條帶；在25 ku下方，AHΔ82比 AH7和 AHΔ148多 3條帶，但在 100 ku處，AHΔ82缺少一條帶(圖3）。

圖2 野生株AH7和突變株AHΔ82、AHΔ148生物被膜的電鏡掃描Fig.2 Scanning electron micrographs of AH7,AHΔ82 and AHΔ148

圖3 野生株AH7和突變株AHΔ82、AHΔ148的全細(xì)胞蛋白SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of whole cell proteins of AH7,AHΔ82 and AHΔ148

2.5 L D50的測(cè)定 野生株AH7的LD50值為2.828×103cfu，突變株 AHΔ82 的 LD50值為 1.027×105cfu，突變株 AHΔ148的 LD50值為 1.47×104cfu，表明突變株毒力較野生株毒力降低。

2.6 MI C的測(cè)定 突變株對(duì)6種常用抗生素的MIC測(cè)定結(jié)果顯示，四環(huán)素、紅霉素、氯霉素和恩諾沙星對(duì)野生株和突變株的MIC相同，鏈霉素和環(huán)丙沙星對(duì)突變株AHΔ82的MIC較野生株降低(表2）。

表2 野生株與突變株對(duì)不同抗生素的MIC的比較Table 2 Comparision of the MIC between wild type and mutant types

3 討 論

mTn5gusA-pgfp21轉(zhuǎn)座子構(gòu)建于自殺性質(zhì)粒pUT，序列中有來(lái)自R6K質(zhì)粒的π蛋白依賴性復(fù)制起點(diǎn)，因此質(zhì)粒只能在表達(dá)π蛋白的菌株中復(fù)制，如 λpir 溶源性感染的E.coliS17-λpir(SmR）、SM10-λpir(KmR）和 CC118-λpir。質(zhì)粒中有 RP4 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移起點(diǎn)oriT，因此可以接合性轉(zhuǎn)移至受體菌。另外序列中還帶有Tnp5基因，編碼轉(zhuǎn)座酶，是mini-Tn5轉(zhuǎn)座所必需的。轉(zhuǎn)座時(shí)該片段不進(jìn)入受體菌的染色體，因此轉(zhuǎn)座后染色體上的轉(zhuǎn)座片段不會(huì)發(fā)生二次轉(zhuǎn)移。當(dāng)轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入到受體菌的染色體上某個(gè)基因后，可以引起該基因突變，導(dǎo)致受體菌表型發(fā)生改變。插入突變后，受體菌獲得抗Km表型，也可以通過(guò)PCR擴(kuò)增插入的gusA基因和gfp基因片段進(jìn)行鑒定。本研究利用mTn5gusA-pgfp21轉(zhuǎn)座子進(jìn)行二親本接合構(gòu)建了AH7的突變體庫(kù)，篩選BF形成量發(fā)生變化的突變株，并對(duì)兩株典型突變株的一些生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。

通過(guò)對(duì)l47株嗜水氣單胞菌突變株的BF進(jìn)行測(cè)定篩選，挑選出成膜能力較強(qiáng)和較弱的兩株突變株。兩株突變株BF形成能力發(fā)生變化，可能是由于Tn5的插入影響了與BF形成相關(guān)的功能基因或調(diào)控基因，從而使BF的構(gòu)成成分發(fā)生變化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，兩株突變株與野生株的蛋白產(chǎn)生有差異，表明這些差異蛋白可能與BF的形成有關(guān)，而許多研究也證明蛋白質(zhì)是BF的關(guān)鍵成分，如金黃色葡萄球菌發(fā)現(xiàn)有Bap(BF相關(guān)蛋白）和E.coli和部分沙門(mén)氏菌的菌毛蛋白和鞭毛蛋白等均參與BF的形成[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩株突變株除了成膜能力改變外，其毒力和對(duì)一些抗生素的敏感性也發(fā)生了變化。與野生株相比，兩株突變株對(duì)斑馬魚(yú)的毒力均減弱，但減弱程度不同，提示轉(zhuǎn)座子插入到了不同的與毒力相關(guān)的基因，因此引起的毒力變化程度不一，這也與嗜水氣單胞菌有多種毒力因子的特征相符合。MICs測(cè)定結(jié)果顯示，只有突變株AHΔ82對(duì)鏈霉素和環(huán)丙沙星的敏感性增強(qiáng)，表明BF的形成與細(xì)菌毒力和耐藥性有一定的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BF形成量較大的突變株AHΔ82毒力反而較小，而B(niǎo)F較小的AHΔ148的毒力反而較大，這與一些研究結(jié)果不相符合[8]。但突變株AHΔ82毒力較弱，對(duì)一些抗生素的敏感性相應(yīng)也強(qiáng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符[9-10]。

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Construction and character of biofilm mutants ofAeromonas hydrophicaby the transposon of mTn5gusA-pgfp21

MA You-zhi1,YU Yuan-yuan1,SHU Miao-an1,HU Bin2,XU Hai-sheng1*
(1.College of Animal Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2.Public Service Center of Agriculture of Yangjiabu in Huzhou,Huzhou 313005,China）

Characterization of the functional genes and related regulation elements is the basis to understand the mechanism of bacterial biofilm formation.In the present study,the suicide plasmid pFAJ1819,carrying a transposon mTn5gusA-pgfp21,was transferred to the recipientAeromona hydrophilaAH7 strain to generate an insertional mutant library by cell conjugation between the donorEscherichia coliS17-1λpir(pFAJ1819）and the recipientA.hydrophila.A total of 153 mutants were screened and two mutants named AHΔ148 and AHΔ82 stably exhibited differences in biofilm formation.The morphological differences of biofilms of AHΔ148,AHΔ82 and AH7 were observed by scanning electron microscopy,of which AH7 and AHΔ82 developed higher density biofilm than AHΔ148.In addition,SDS-PAGE analysis showed that the protein patterns had a slightly difference between the mutant and parental bacteria.However,the pathogenicity tests displayed a trend of attenuated virulence for the mutatedA.hydrophila,which the medial lethal dose were 2.828×103cfu for AH7,1.027×104 cfu for AHΔ148 and 1.027×105cfu for AHΔ82 tested in zebra fish.These results demonstrated that the insertion of Tn5-transposon affected the formation of bacterial biofilm and virulence.

Aeromonas hydrophica;biofilm;Tn5;mutant

S852.6

A

1008-0589(2014）04-0265-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.04.03

*Correspondingauthor

2013-05-12

浙江省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目(2011R50029）；湖州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011GN07、2012GN13）

馬有智(1963-），陜西楊凌人，博士，副教授，主要從事動(dòng)物微生物學(xué)基礎(chǔ)理論與應(yīng)用研究.

*通信作者：E-mail：hsxu@zju.edu.cn

(本文編輯：彭永剛）