潘福星，王冬冬，曹志偉，馮培祥，劉 宏，齊 娟，孫忠晟，王祖榮，尹燕博*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.青島澳蘭百特生物工程有限公司，山東青島 266101；3.青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，山東青島 266225）

比格犬IFN-α和IFN-βmRNASYB RGreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立

潘福星1，王冬冬1，曹志偉1，馮培祥1，劉 宏1，齊 娟2，孫忠晟2，王祖榮3，尹燕博1*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.青島澳蘭百特生物工程有限公司，山東青島 266101；3.青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，山東青島 266225）

為檢測(cè)比格犬α和β-干擾素(CaIFN-α和CaIFN-β），本研究根據(jù)GenBank中登錄的IFN-α和IFN-β基因序列，分別設(shè)計(jì)合成特異性引物，以犬3-磷酸甘油脫氫酶(GAPDH）mRNA為內(nèi)參，建立SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。通過(guò)RT-PCR分別擴(kuò)增IFN-α、IFN-β和GAPDH的基因片段，并克隆于pMD19-T載體中制備標(biāo)準(zhǔn)品，建立熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：IFN-α和IFN-β和GAPDH基因的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度在1×102拷貝/μL～1×108拷貝/μL內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.994。組內(nèi)組間變異系數(shù)均小于3%，特異性和重復(fù)性較好。同時(shí)采用常規(guī)RT-PCR方法與本研究建立的方法對(duì)30份臨床樣品檢測(cè)，結(jié)果顯示IFN-α和IFN-β的陽(yáng)性符合率分別為96.43%和96.55%。本研究建立的檢測(cè)方法為比格犬IFN mRNA的定量分析提供了有效手段。

SYBR Green I；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR；比格犬；α-干擾素；β-干擾素

干擾素(Interferon，IFN）是一種多功能高活性的糖蛋白，具有廣譜抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能[1]。其主要分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型IFN(IFN-α、β和ω）以抗病毒為主，Ⅱ型IFN(IFN-γ）則以免疫調(diào)節(jié)為主[2]。

比格犬已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、病理學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域，并且在以犬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究中，只有比格犬才被國(guó)際公認(rèn)。但由于比格犬受犬細(xì)小病毒病、犬瘟熱等病毒病的危害較大，通過(guò)檢測(cè)機(jī)體內(nèi)IFN的mRNA含量變化，可以初步對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的活化程度做出評(píng)價(jià)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR因其敏感性高、重復(fù)性好、操作方便和污染少等優(yōu)點(diǎn)[3]，在豬[4]、雞[5]和牛[6]細(xì)胞因子的檢測(cè)中已有報(bào)道。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)比格犬IFN(CaIFN）的檢測(cè)方法主要是ELISA[7]，尚未見有關(guān)CaIFN實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)的報(bào)道。為了快速、敏感、準(zhǔn)確檢測(cè)CaIFN-α和 CaIFN-β，本實(shí)驗(yàn)建立了一種針對(duì)CaIFN-α 和 CaIFN-β 分子 mRNA 的 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，為研究比格犬在受病毒感染時(shí)體內(nèi)CaIFN-α和CaIFN-β在mRNA水平上的表達(dá)規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌種 比格犬由青島博隆比格犬養(yǎng)殖有限公司提供；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 Plasmidmini Kit購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；M-MLV購(gòu)自Promega公司；FastSrart Universal SYBR Green Master(ROX）購(gòu)自Roche公司；RNAprep pure Blood Kit購(gòu)自天根生化科技(北京）有限公司；RNase Inhibitor、TaqDNA聚合酶、pMD19-T載體、Gel Extraction Kit均購(gòu)自寶生物工程(大連）有限公司；PQD-33A熒光定量RT-PCR儀購(gòu)自BIOER公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的CaIFN-α (AB255372）和 CaIFN-β (NM001135787）和CaGAPDH(U31247）基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR特異性引物，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成(表1）。

1.4 總R N A的提取與c D N A合成 按照RNAprep pure Blood Kit產(chǎn)品說(shuō)明操作，從2 mL比格犬抗凝外周血中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，-20℃保存待用。

表1 擴(kuò)增CaIFN-α和CaIFN-β及CaGAPDH基因的引物Table 1 The primers used in this study

1.5 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以cDNA為模板，分別對(duì)CaIFN-α和CaIFN-β和 CaGAPDH進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

將PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化后連接pMD19-T，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，通過(guò)菌液PCR鑒定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析，提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒，分別測(cè)定各質(zhì)粒OD260nm值和OD280nm值，根據(jù)公式計(jì)算核酸濃度：待測(cè)樣本濃度(ng/μL）=OD260nm值×40×稀釋倍數(shù)。并按照公式計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)：拷貝數(shù)(copies/μL）=濃度(ng/μL）×6.02×1014/分子質(zhì)量。10 倍倍比稀釋，使質(zhì)粒濃度為 1×101copies/μL～1×1010copies/μL，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)平行，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化 采用相同濃度的模板，分別對(duì)引物濃度和反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化；采用梯度PCR選擇最佳Tm值。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線性的建立 用ddH2O將各陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行 10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8稀釋，以優(yōu)化的體系進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)，根據(jù)Ct值和各質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。

1.8 特異性試驗(yàn) 按1.4的方法進(jìn)行總RNA的提取和cDNA的合成，用CaIFN-α、CaIFN-β和CaGAPDH的各自引物進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)，并對(duì)產(chǎn)物的熔解曲線進(jìn)行分析。

1.9 敏感性試 驗(yàn) 以 1×101copies/μL～1×1010copies/μL梯度稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，確定檢出下限。

1.1 0 重復(fù)性試驗(yàn) 將3種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成3個(gè)濃度梯度，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)時(shí)，每個(gè)稀釋度重復(fù)3孔；進(jìn)行組間重復(fù)性試驗(yàn)時(shí)，同一次反應(yīng)每個(gè)稀釋度重復(fù)3孔，重復(fù)3次。

1.1 1 符合率檢測(cè) 臨床無(wú)菌取30份90日齡比格犬血液樣品，利用建立的熒光定量RT-PCR方法和常規(guī)RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)兩種方法的陽(yáng)性結(jié)果，比較兩種方法的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與目的基因大小一致的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后獲得陽(yáng)性克隆。經(jīng)測(cè)序后表明構(gòu)建了質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，3種目的基因的序列與GenBank參考序列的核苷酸一致性均為100%。純化后的陽(yáng)性質(zhì)粒OD260nm/OD280nm值分別為1.81，1.86，1.87。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Amplification of the target genes by RT-PCR

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用SYBR Green I染料法，進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴(kuò)增和優(yōu)化，結(jié)果表明當(dāng)引物濃度為25 pmol/μL，退火溫度分別為56℃、55℃、60℃時(shí)有最低的Ct值和最高的熒光強(qiáng)度，并且無(wú)二聚體。優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：cDNA 5 μL，F(xiàn)ast-Start Universal SYBR Green Master(ROX）25 μL ，上、下游引物(25 mmol/L）各 0.5 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件為50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s、58℃1 min，40個(gè)循環(huán)。采集熒光進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 3種基因的陽(yáng)性質(zhì)粒以1:10倍比稀釋后作為模板，進(jìn)行熒光定量RT-PCR，計(jì)算Ct值，并繪制擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2，表2）。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)R2介于0.994～0.999。

2.4 特異性試驗(yàn) 以 CaIFN-α、CaIFN-β 和 CaGAPDH的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，分別用CaIFN-α、CaIFN-β和CaGAPDH的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明僅當(dāng)模板為pMD19-T-IFN-α，引物為IFN-α；當(dāng)模板為 pMD19-T-IFN-β，引物為 IFN-β；模板為pMD19-T-CaGAPDH，引物為CaGAPDH時(shí)，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，而其它組合均無(wú)熒光信號(hào)(圖3），熔解曲線顯示3種分子均出現(xiàn)特異性單峰，表明建立的方法具有良好的特異性。

圖2 熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of IFN-α,IFN-β and GAPDH real-time RT-PCR

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)參數(shù)Table 2 Relative parameters of standard curve

圖3 CaIFN-α、CaIFN-β和CaGAPDH基因的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR特異性檢測(cè)Fig.3 Specificity test of CaIFN-α,CaIFN-β and CaGAPDH genes by real-time fluorescent quantitative PCR

2.5 敏感性試 驗(yàn) 以 1×101copies/μL～1×1010copies/μL梯度稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR，結(jié)果表明，在10-10稀釋度時(shí)仍有熒光信號(hào)，CaIFN-α、CaIFN-β和CaGAPDH的Ct值的平均值分別為33.35，27.15和30.54，均少于35，因此判斷這3種基因的檢出下限為1 copies/μL。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別對(duì) CaIFN-α和CaIFN-β和CaGAPDH基因進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明CV值均在3%以內(nèi)，重復(fù)性良好(表3）。

2.7 符合率檢測(cè) 分別利用建立的熒光定量RT-PCR方法和常規(guī)RT-PCR檢測(cè)30份臨床樣品，結(jié)果IFN-α的陽(yáng)性符合率是96.43%，IFN-β的符合率是96.55%。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)Table 3 Intra-assay and inter-assay reproducibility of CaIFN-α,CaIFN-β and CaGAPDH genes

3 討 論

細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答的重要效應(yīng)分子[8]。建立一種針對(duì)CaIFN-α和CaIFN-β快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法在犬病毒病的診斷方面具有重要意義。與普通PCR相比，熒光定量RT-PCR節(jié)省時(shí)間，并且提高了實(shí)驗(yàn)效率[9]。目前已被廣泛的用于定量檢測(cè)，但缺點(diǎn)是易產(chǎn)生假陽(yáng)性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)控制引物濃度，優(yōu)化反應(yīng)條件，設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)克服這一缺點(diǎn)。

本研究在擴(kuò)增CaIFN-α和CaIFN-β基因的同時(shí)，以CaGAPDH基因?yàn)閰⒖?，建立了針?duì)比格犬IFN-α和IFN-β的mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明，3種基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系；以重新提取的基因組為模板，用3種引物進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)，只出現(xiàn)3條擴(kuò)增曲線，并無(wú)其他擴(kuò)增曲線的出現(xiàn)，同時(shí)溶解曲線呈現(xiàn)單一的峰值，表明所用3個(gè)基因的引物具有較好的特異性；擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)較好的S型，檢出下限均為1 copies/μL，敏感性良好；組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均少于3%，具有較好的重復(fù)性；熒光定量RT-PCR與常規(guī)RT-PCR臨床檢出IFN-α和IFN-β的符合率分別為96.43%和96.55%，熒光定量RT-PCR的檢出率高于常規(guī)RT-PCR法，表明本研究建立的方法較好。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了比格犬CaIFN-α和CaIFN-β兩種細(xì)胞因子的SYBR GreenⅠ熒光定量檢測(cè)方法，同時(shí)為兩種主要的抗病毒細(xì)胞因子IFN-α和IFN-β mRNA在比格犬體內(nèi)表達(dá)水平的檢測(cè)提供了新的方法。

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Establishment of a SYBR Green based real-time PCR for detection of Beagles alpha-interferon and bata-interferon mRNA

PAN Fu-xing1,WANG Dong-dong1,CAO Zhi-wei1,FENG Pei-xiang1,LIU Hong1,QI Juan2,SUN Zhong-cheng2,WANG Zu-rong3,YIN Yan-bo1*

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China;2.Qingdao Oland-Better Bioengineering Co.,LTD,Qingdao 266101,China;3.Qingdao Bolong Experimental Animal Co.,LTD,Qingdao 266225,China）

In order to determinate the levels of canine IFN-α and IFN-β (CaIFN-α and CaIFN-β）,we established a SYBR Green based real-time PCR method with two pairs of special primers designed according to the CaIFN-α and CaIFN-β sequences in GenBank,and using the canine glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase(CaGAPDH）mRNA as an internal control.In addition,the target genes were amplified by RT-PCR and inserted to pMD19-T vector as the standard recombinant plasmids for the establishing the real-time PCR standard curves.The results showed that the Ct value of CaIFN-α,CaIFN-β or CaGAPDH mRNA had a linear relationship(R2>0.994）,with a detection levels from 102copies/μL to 108copies/μL.The coefficient variations of inter-assay and intra-assay were both less than 3%,which showed a good specificity and reproducibility.The positive coincidence rates of CaIFN-α and CaIFN-β were 96.43%and 96.55%,respectively,through comparison of detecting 30 clinical samples,using RT-PCR and the established method.Therefore,the established real-time PCR method could be an effective method for quantitative analysis of IFN mRNA.

SYBR Green I;real-time fluorescent quantitative RT-PCR;Beagles;IFN-α;IFN-β

S852.7

A

1008-0589(2014）04-0297-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.04.11

*Correspondingauthor

2013-06-17

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(2012AA101303）

潘福星(1986-），男，山東萊陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究.

*通信作者：E-mail：yanboyin2011@163.com

(本文編輯：彭永剛）