張 璐，王延群，郝立沙，高明明，李?lèi)?ài)東，陶 冶，李 莉，涂亞斌，蔡雪輝*，路義鑫*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物疫病診斷中心，黑龍江哈爾濱 150001）

豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白單克隆抗體制備及線性抗原表位鑒定

張 璐1，王延群2，郝立沙2，高明明2，李?lèi)?ài)東2，陶 冶2，李 莉2，涂亞斌2，蔡雪輝2*，路義鑫1*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物疫病診斷中心，黑龍江哈爾濱 150001）

為制備豬圓環(huán)病毒2型(PCV2）Cap蛋白單克隆抗體(MAb）及鑒定其抗原表位，本研究采用PCV2去核定位信號(hào)Cap蛋白(dCap），通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備1株雜交瘤細(xì)胞株(4E2），制備小鼠腹水效價(jià)達(dá)1∶64 000，亞類(lèi)鑒定為IgG1/κ鏈。Western blot分析顯示，該株MAb與畢赤酵母表達(dá)的dCap和原核表達(dá)的Cap蛋白均可以發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。采用肽掃描法對(duì)MAb的非核定位信號(hào)區(qū)進(jìn)行抗原表位鑒定，結(jié)果表明該MAb可以識(shí)別的線性表位區(qū)域?yàn)?31TKATALTYDPYVNYSS146。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究Cap蛋白的結(jié)構(gòu)和PCV2臨床檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

豬圓環(huán)病毒2型；dCap；單克隆抗體；表位

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV）可以分為兩種血清型，即PCV1和PCV2[1]，其中只有PCV2具有致病性，可以導(dǎo)致豬群繼發(fā)感染其他病原并可以產(chǎn)生免疫抑制病。當(dāng)前普遍認(rèn)為PCV2是引起仔豬斷奶多系統(tǒng)綜合征(PMWS）的主要原因[2]。

PCV2為單股環(huán)狀DNA病毒，全長(zhǎng)為1 766 nt～1 768 nt，其中包含兩個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs）：ORF1編碼該病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白R(shí)ep和Rep'，參與病毒的復(fù)制；ORF2編碼該病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白。Cap蛋白的aa 1～aa 41為核定位信號(hào)區(qū)，其余為非核定位信號(hào)區(qū)域，許多研究表明Cap蛋白的抗原表位多集中在該區(qū)域：Shang等利用肽段掃描法鑒定出該區(qū)域5個(gè)B細(xì)胞的線性表位，其中aa 231～aa 233，aa 195～aa 202為 PCV2的特異性表位，aa 92～aa 103為PCV1特異性表位，而aa 156～aa 162和aa 175～aa 192為PCV1和PCV2共同識(shí)別的表位[3]；Lefebvre等利用單克隆抗體(MAb）與不同病毒Cap蛋白免疫反應(yīng)性差異，證明不同PCV2病毒株存在抗原差異[4]。除了線性表位之外，Huang等也通過(guò)感染性克隆技術(shù)鑒定出第59位氨基酸的位置是PCV2的一個(gè)構(gòu)象表位[5]；Lekcharoensuk等利用構(gòu)建嵌合病毒，鑒定出在aa 47～aa 85，aa 165～aa 200和aa 230～aa 233這3個(gè)區(qū)域內(nèi)有5個(gè)相互重疊的構(gòu)象表位[6]。本研究對(duì)非核定位信號(hào)區(qū)的Cap蛋白(dCap）進(jìn)行表達(dá)純化，通過(guò)制備MAb，從而對(duì)該區(qū)域的抗原表位進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 dCap蛋白及原核表達(dá)Cap蛋白均由哈爾濱獸醫(yī)研究所診斷中心提供；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；抗Cap蛋白陽(yáng)性血清為dCap蛋白免疫小鼠制備，陰性血清為未免疫小鼠血清；5周齡～7周齡BALB/c雌性小鼠購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體(HRP-IgG）、弗氏完全佐劑、PEG4000、HAT、HT均購(gòu)自Sigma公司；MAb亞型檢測(cè)試劑盒購(gòu)自SouthernBiotect公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB）顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB底物顯色液購(gòu)自天根生化科技(北京）有限公司。

1.2 MAb的制備 將弗氏完全佐劑與dCap蛋白混合進(jìn)行乳化制備免疫原，劑量為100 μg/只，按常規(guī)免疫程序免疫小鼠。四免后取小鼠脾淋巴細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。以純化的dCap蛋白[7]為抗原建立間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，采取有限稀釋法進(jìn)行多次亞克隆，具體操作方法參考文獻(xiàn)[8]。

1.3 MAb效價(jià)測(cè)定及亞型鑒定 利用篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞制備腹水，并采取辛酸-飽和硫酸銨方法純化腹水，制備方法參考文獻(xiàn)[8]，通過(guò)間接ELISA方法檢測(cè)腹水效價(jià)。使用SouthernBiotect公司的MAb亞型分類(lèi)試劑盒進(jìn)行MAb亞型鑒定。

1.4 Westernblot鑒定和間接免疫熒光(IFA）檢測(cè)將畢赤酵母表達(dá)的dCap蛋白和原核表達(dá)的Cap蛋白分別進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜處理，以MAb為一抗，山羊抗鼠HRP-IgG為二抗，SP2/0上清液作為陰性對(duì)照，DAB試劑盒顯色，進(jìn)行western blot分析。將PCV2感染PK15單層細(xì)胞，48 h后棄上清液，利用冰的無(wú)水乙醇固定，以MAb為一抗，山羊抗鼠FITC-IgG為二抗，同時(shí)設(shè)立小鼠陽(yáng)性血清和陰性血清做對(duì)照，進(jìn)行IFA鑒定。

1.5 肽掃描法對(duì)抗原表位定位 根據(jù)GenBank中登錄的PCV2(FJ644559.1）基因序列，通過(guò)DNAStar軟件分析dCap蛋白氨基酸序列，設(shè)計(jì)19個(gè)短肽，其中每個(gè)短肽含有16個(gè)氨基酸，前后重疊6個(gè)氨基酸(表1）。利用原核表達(dá)系統(tǒng)，選取pMAL-c4xTM載體表達(dá)一系列短肽。將表達(dá)出的短肽與MAb進(jìn)行dot blot和間接ELISA分析。

表1 根據(jù)dCap蛋白氨基酸序列設(shè)計(jì)的短肽序列Table 1 Design of the peptide sequence overlapping PCV2 dCap coding region

2 結(jié) 果

2.1 MA b的制備和篩選 利用酵母表達(dá)純化后的dCap蛋白免疫小鼠，將小鼠的脾淋巴細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，通過(guò)間接ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清液，經(jīng)過(guò)3次亞克隆純化后篩選到一株能夠穩(wěn)定分泌抗dCap蛋白特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞系，命名為4E2。

2.2 MA b亞型鑒定和效價(jià)檢測(cè) 利用MAb亞型檢測(cè)試劑盒鑒定結(jié)果表明，MAb 4E2屬于IgG1，輕鏈為κ；間接ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清液抗體效價(jià)為 1∶1 200，腹水經(jīng)純化后效價(jià)為 1∶64 000。

2.3 We s t e r nb l o t鑒定 將MAb分別與畢赤酵母表達(dá)的dCap蛋白和原核表達(dá)的Cap蛋白反應(yīng)，western blot分析結(jié)果顯示所制備MAb不僅與dCap蛋白反應(yīng)還可以與原核表達(dá)的Cap蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)(圖 1）。

圖1 MAb與酵母表達(dá)dCap蛋白和大腸桿菌表達(dá)Cap蛋白的western blot鑒定Fig.1 Reaction analysis of MAb with dCap and Cap by western blot

2.4 I F A鑒定 PCV2感染PK15細(xì)胞48 h后，利用MAb進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果顯示，該MAb和陽(yáng)性血清組均檢測(cè)到綠色的熒光信號(hào)，而陰性對(duì)照組無(wú)反應(yīng)，表明該MAb能夠與PCV2發(fā)生特異性反應(yīng)(圖 2）。

2.5 MA b識(shí)別抗原表位初步鑒定 將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液與所表達(dá)的短肽進(jìn)行dot blot和間接ELISA檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，該株MAb除與dCap蛋白外僅可以與JD-10肽段抗原呈陽(yáng)性反應(yīng)(圖3，圖4），表明MAb識(shí)別表位位于該區(qū)域131TKATALTYDPYVNYSS146。

圖2 MAb的IFA鑒定結(jié)果Fig.2 Indentification of the MAb in PK15 infected PCV2 by IFA

圖3 Dot blot鑒定MAb識(shí)別的抗原表位分析Fig.3 Indentification of the MAb epitope by dot blot

圖4 肽段ELISA掃描鑒定MAb識(shí)別的抗原表位分析Fig.4 Indentification of the MAb epitope by iELISA

3 討 論

Cap蛋白為PCV2病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其蛋白N端前41個(gè)氨基酸是病毒核內(nèi)定位信號(hào)，含有酵母的稀有密碼子，影響了外源蛋白的高效表達(dá)[7]，所以本研究去除Cap蛋白的核定位信號(hào)區(qū)域，對(duì)主要抗原結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行表達(dá)，不但能夠利用酵母表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)出外源蛋白，而且對(duì)蛋白的抗原結(jié)構(gòu)無(wú)嚴(yán)重影響，有利于疫苗的制備和血清學(xué)診斷方法的建立。

利用所表達(dá)的dCap制備MAb，對(duì)該MAb識(shí)別的抗原表位進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，所制備的雜交瘤細(xì)胞能夠穩(wěn)定分泌抗dCap的MAb，制備的腹水效價(jià)達(dá)到1∶64 000。通過(guò)western blot分析，MAb不僅識(shí)別酵母表達(dá)的dCap，而且與原核表達(dá)的Cap蛋白也存在著免疫反應(yīng)。將截短的dCap短肽與MBP標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，抗原表位鑒定結(jié)果顯示，MAb只與JD-10肽段反應(yīng)，dot blot和間接ELISA結(jié)果相一致，表明MAb識(shí)別的抗原表位只在此區(qū)域，對(duì)應(yīng)的序列131TKATALTYDPYVNYSS146為MAb的線性表位。該表位屬于首次鑒定的Cap蛋白的新線性抗原表位，與目前文獻(xiàn)報(bào)道存在差異[6,9-10]。

本研究制備了一株高效價(jià)、特異性良好的MAb，并首次鑒定出Cap蛋白新的表位區(qū)域，為進(jìn)一步研究Cap蛋白功能及PCV2的臨床檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

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Preparation of the monoclonal antibody against Cap protein of porcine circovirus type 2 and its antigenic epitope identification

ZHANG Lu1,WANG Yan-qun2,HAO Li-sha2,GAO Ming-ming2,LI Ai-dong2,TAO Ye2,LI Li2,TU Ya-bin2,CAI Xue-hui2*,LU Yi-xin1*

(1.College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Animal Disease Diagnosis Center,State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China）

To prepare monoclonal antibodies(MAb）against Cap protein of porcine circovirus II(PCV2）and identify the antigen epitope,a MAb against PCV2 was prepared by lymphocyte hybridoma technique with the recombinant Cap protein without nuclear location signal(dCap）expressed byP.pastoria.The MAb was belonged to IgG1 subclass and κ light chain.The ELISA titer of MAb was 1∶64 000 in ascites.Western blot indicated that MAb was reacted with PCV2-dCap expressed inP.pastoriaand PCV2-Cap expressed inE.coli.IFA assay showed the MAb was reacted with PCV2 in PK15 cells.Furthermore,the MAb recognized dCap protein epitope of131TKATALTYDPYVNYSS146mapped by a serious of prokaryotic expressed peptides.The MAb prepared in this study is useful tool for developing immunological diagnostic techniques of PCV2 and further investigation of the Cap protein.

porcine circovirus type 2;dCap;monoclonal antibody;antigenic epitope

S852.65

A

1008-0589(2014）04-0310-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.04.14

*Correspondingauthor

2013-10-11

“十二五”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2011AA10A213）；哈爾濱市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2010AA6AN083）；黑龍江省自然科學(xué)基金(C201047）

張 璐(1989-），女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究.

*通信作者：E-mail：luyixin@neau.edu.cn;aci139@sina.com

(本文編輯：任安琦）