方 敏 彭春偉 陳 創(chuàng) 龐代文 李 雁

基于量子點標(biāo)記探針技術(shù)的腫瘤分子分型研究進(jìn)展*

方 敏①彭春偉①陳 創(chuàng)②龐代文③李 雁①

李雁 教授，醫(yī)學(xué)博士，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，現(xiàn)任武漢大學(xué)珞珈學(xué)者特聘教授，武漢大學(xué)腫瘤研究所所長，為教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃及湖北省政府特殊津貼獲得者。美國臨床腫瘤學(xué)會會員，中國抗癌協(xié)會納米腫瘤技術(shù)專業(yè)委員會常委，Biomaterials雜志（IF=7.882）副主編。主要從事消化道腫瘤的外科綜合治療，尤其是腹膜癌的綜合治療和基于納米熒光探針技術(shù)的腫瘤微觀分子影像學(xué)研究。主持國家自然科學(xué)基金重點項目和面上項目5項，承擔(dān)國家重大科技專項2項。發(fā)表SCI論文88篇，影響因子累計超過280?？蒲谐晒@全國優(yōu)秀博士論文（2004年），國家科技進(jìn)步一等獎（2006年），美國臨床腫瘤學(xué)會IDEA獎（2008年），湖北省科技進(jìn)步一等獎（2011年）。

惡性腫瘤在分子水平上具有高度異質(zhì)性，是個體化治療的依據(jù)。發(fā)展同時顯示腫瘤原位多分子指標(biāo)的技術(shù)對研究腫瘤生物學(xué)行為至關(guān)重要。量子點標(biāo)記探針技術(shù)因其具有獨特的光學(xué)和化學(xué)特性，在腫瘤診斷、監(jiān)測、治療、發(fā)病機(jī)制、分子分型及異質(zhì)性研究中均有廣闊應(yīng)用前景。本文總結(jié)該技術(shù)在腫瘤分子分型方面的應(yīng)用進(jìn)展。

量子點 腫瘤 分子分型 多色成像

腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與、多階段漸進(jìn)的過程，腫瘤異質(zhì)性使不同個體對治療反應(yīng)迥異。因此，根據(jù)腫瘤不同生物學(xué)行為特征建立腫瘤分子分型，以此確定相應(yīng)的腫瘤個體化治療策略，是臨床腫瘤學(xué)的重要發(fā)展方向［1］。

1 分子分型的概念及其意義

腫瘤分子分型（molecular classification）系采用高通量分子分析技術(shù)，根據(jù)分子遺傳學(xué)或分子生物改變特征，使腫瘤的分類由主要依賴形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)向以分子特征為基礎(chǔ)的新分類系統(tǒng)［2］；分子分型可不依賴于組織形態(tài)學(xué)鑒定，卻可對后者進(jìn)行有效補(bǔ)充。長期以來，組織病理學(xué)在腫瘤分型中一直處于主導(dǎo)地位，但臨床實踐日益顯示，普通病理形態(tài)學(xué)已不能滿足臨床需要。以乳腺癌為例，以TNM分期系統(tǒng)為基礎(chǔ)的分類體系，一直是乳腺癌綜合治療的主要依據(jù)［3］。該體系以病理形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，綜合考慮腫瘤大小（T）、淋巴結(jié)狀態(tài)（N）、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M），在一定程度上揭示了乳腺癌的生物學(xué)行為特征。盡管如此，臨床實踐表明同一病理類型、同一分期的惡性腫瘤患者，采用同一治療方案，其療效及預(yù)后可能有明顯不同，說明該法尚不能全面展現(xiàn)乳腺癌發(fā)展演變過程中所蘊(yùn)含的重要信息。個體化醫(yī)療為目前乳腺癌診療的主要方向，而準(zhǔn)確的腫瘤分子分型對判斷腫瘤組織學(xué)來源、鑒別組織學(xué)亞型、預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險、選擇個體化治療策略等均至關(guān)重要［4］，迫切需要發(fā)展原位、定量、多分子同時分析技術(shù)，建立適應(yīng)腫瘤個體化治療需求的綜合性分子分型體系。

2 量子點的物理特性及應(yīng)用優(yōu)勢

分子成像技術(shù)是21世紀(jì)最重要的高新技術(shù)之一，基于納米材料標(biāo)記的分子探針技術(shù)在癌癥診斷和治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景［5］。尤其是量子點（Quantum dots，QDs）標(biāo)記分子探針技術(shù)在細(xì)胞分子成像及定量檢測分析方面有顯著優(yōu)勢［6］。量子點是一種直徑在1～10 nm的半導(dǎo)體納米晶粒。核（CdSe/CdS/CdTe）殼（ZnS）結(jié)構(gòu)量子點可與一系列生物靶標(biāo)包括蛋白質(zhì)、抗體、核酸、親和體等結(jié)合形成分子探針，與傳統(tǒng)的熒光染料相比，具有以下優(yōu)勢：1）連續(xù)而寬的激發(fā)光譜，物理尺寸和組份比例可調(diào)性；2）可同時進(jìn)行多色標(biāo)記，檢測靈敏度高；3）抗光漂白能力強(qiáng)；4）熒光強(qiáng)度高而穩(wěn)定；5）生物相容性好，抗組織自發(fā)熒光干擾能力強(qiáng)；6）摩爾熒光量子產(chǎn)率高等。這些優(yōu)點突破了傳統(tǒng)熒光材料探針局限，已在腫瘤的分子成像、細(xì)胞成像和在體成像研究中取得重要進(jìn)展［7］。同時，目前的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等檢測手段主要是對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子進(jìn)行定性、半定量研究，尚不能原位、實時展現(xiàn)關(guān)鍵分子與臨床關(guān)鍵信息的相互作用關(guān)系，因此難以準(zhǔn)確全面揭示腫瘤進(jìn)展演變的規(guī)律，以及在宏觀形態(tài)上實現(xiàn)對腫瘤侵襲行為的綜合評估［8］。多分子成像技術(shù)有望突破這一技術(shù)障礙，有利于實現(xiàn)細(xì)胞或組織水平的原位、實時、定量、多組分、長時程成像，同時結(jié)合快速發(fā)展的生物信息學(xué)技術(shù)，快速有效準(zhǔn)確地提取、挖掘和分析成像信息，為發(fā)展個體化診療提供全新的技術(shù)支撐平臺。

3 量子點標(biāo)記分子探針成像技術(shù)在腫瘤分子分型中的應(yīng)用

盡管組織病理長期以來為腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但已無法滿足腫瘤個體化治療需求；而且，腫瘤大體組織及病理形態(tài)并非總存在特異和典型的改變；因此，分子層面的變化及特點顯得更為實用且有效［9］。量子點標(biāo)記的分子探針技術(shù)能對腫瘤特異性標(biāo)志物實現(xiàn)原位、實時、定量、高靈敏度成像，為腫瘤分子分型提供有效的技術(shù)手段。

3.1 量子點標(biāo)記探針原位單分子成像及定量檢測

量子點在腫瘤分子分型中的應(yīng)用范例是乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的檢測。HER2是表皮生長因子受體家族成員，參與腫瘤增生、血管形成和轉(zhuǎn)移，準(zhǔn)確定位、定量并全面解析其生物學(xué)行為，對乳腺癌個體化治療至關(guān)重要［10］。Wu等［11］利用量子點標(biāo)記技術(shù)成功實現(xiàn)了HER2的靶向檢測。Yezhelyev等［12］也實現(xiàn)了在不同細(xì)胞系及臨床組織標(biāo)本中的HER2檢測，并證實HER2準(zhǔn)確定量在臨床實踐中的應(yīng)用價值，為個體化診療提供依據(jù)。我們課題組也開展了量子點標(biāo)記探針對乳腺癌HER2靶向診斷應(yīng)用基礎(chǔ)研究［7，13-16］（圖1）。首次在乳腺癌臨床病理標(biāo)本中實現(xiàn)了HER2的靶向特異性檢測，評估了量子點標(biāo)記分子探針的可靠性、靈敏性與實用性，初步證實了該技術(shù)的體外定量檢測優(yōu)勢［13］。隨后，進(jìn)一步在大樣本乳腺癌隨訪患者中評估了該體系的價值，基于多光譜技術(shù)進(jìn)一步提高了HER2檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，實現(xiàn)了傳統(tǒng)形態(tài)病理學(xué)關(guān)鍵指標(biāo)腫瘤大小與HER2定量參數(shù)的整合，提出了乳腺癌HER2總量的概念。結(jié)果表明，用HER2總量來評估HER2狀態(tài)，與目前檢測金標(biāo)準(zhǔn)具有較高的一致性，可以較好地揭示乳腺癌HER2表達(dá)的生物學(xué)規(guī)律，可以甄別出目前傳統(tǒng)方法難以發(fā)現(xiàn)的乳腺癌新亞型。以此來指導(dǎo)的乳腺癌分子靶向治療，有望進(jìn)一步提高乳腺癌療效，推動乳腺癌的個體化、規(guī)范化治療［15］。最近，通過對激素受體的定量與定性分析，建立了基于激素受體表達(dá)的亞型分類新標(biāo)準(zhǔn)，并聯(lián)合HER2總量新指標(biāo)，實現(xiàn)了乳腺癌亞型預(yù)后差異的有效預(yù)測［16］。

除了在乳腺癌研究中的應(yīng)用外，Li等［17］利用量子點標(biāo)記分子探針聯(lián)合多光譜分析技術(shù)實現(xiàn)了對人前列腺癌Akt-1的定量檢測，高通量組織芯片分析表明，高表達(dá)Akt-1與患者高特異性復(fù)發(fā)及死亡風(fēng)險密切相關(guān)，該研究證實了量子點標(biāo)記分子探針的定量檢測優(yōu)勢。最近，Zhao等［18］基于量子點標(biāo)記分子探針技術(shù)，實現(xiàn)了胃癌中Caveolin-1的定量檢測，預(yù)測胃癌預(yù)后。

3.2 量子點標(biāo)記探針原位多分子共成像

基于量子點標(biāo)記探針多分子成像技術(shù)在個體化評估腫瘤生物學(xué)行為、鑒別診斷、分期分型及治療方案制定等方面意義更大（表1）。Ghazani等［19］利用該技術(shù)對肺癌組織芯片進(jìn)行多分子成像，結(jié)合計算機(jī)信息獲取及計算方法，成功建立肺癌中三種關(guān)鍵蛋白表達(dá)信息的綜合分析方法，為肺癌的診斷和治療提供了新思路。Snyder等［21］利用該技術(shù)，對乳腺癌組織切片的三種標(biāo)記分子CD44、CD24和Ki67進(jìn)行原位多色成像，結(jié)果表明，在CD44和CD24亞組中，Ki67陽性率是不同的，這為不同亞組采取不同的治療手段提供依據(jù)。

Liu等［22］也利用該技術(shù)成功建立了霍奇金淋巴瘤的分子分型方法。Reed-Sternberg（RS）細(xì)胞是病理診斷霍奇金淋巴瘤的標(biāo)志，但其數(shù)量只占了淋巴組織中異質(zhì)性浸潤淋巴細(xì)胞的1%，診斷困難。基于量子點多色成像技術(shù)通過原位同時顯示組織切片中的CD15、CD30、CD45和Pax5四種分子，可快速將霍奇金淋巴瘤中的少量異質(zhì)性RS細(xì)胞（CD15+/CD30+/CD45-/Pax5+）從大量淋巴細(xì)胞中鑒別出來。該診斷技術(shù)已應(yīng)用于臨床轉(zhuǎn)化研究，包括6例霍奇金淋巴瘤，2例可疑淋巴瘤和2例良性淋巴結(jié)增生。因此，基于量子點多色成像的腫瘤分子分型技術(shù)，有望提高對異質(zhì)性RS細(xì)胞的檢測靈敏度，提高霍奇金淋巴瘤的診斷分型準(zhǔn)確度。

圖1 量子點標(biāo)記探針技術(shù)在分子病理中的應(yīng)用Figure 1 QD-based immunohistochemistry（IHC）labeled the molecular pathology

表1 基于量子點多分子成像技術(shù)的腫瘤分子分型研究Table 1 Molecular classification of tumors using quantum dot-based multiplexed imaging

3.3 量子點標(biāo)記探針對腫瘤微環(huán)境的分子分型研究

1889年P(guān)aget提出“種子和土壤學(xué)說”，器官微環(huán)境可影響特定腫瘤細(xì)胞的存活、生長和侵襲。本課題組也開展了基于腫瘤微環(huán)境分析的胃癌分子分型研究（圖2）。基于量子點標(biāo)記分子探針技術(shù)，對腫瘤微環(huán)境關(guān)鍵分子進(jìn)行原位多色成像，包括間質(zhì)的主要成分Ⅳ型膠原，間質(zhì)降解主要成分MMP9，免疫浸潤細(xì)胞的代表巨噬細(xì)胞以及腫瘤新生血管標(biāo)志CD105，揭示了腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境的協(xié)同進(jìn)化過程，提出微環(huán)境的5種特征［8，23-24］，并將腫瘤侵襲模式分為4種類型［23］。同時，根據(jù)間質(zhì)巨噬細(xì)胞的浸潤程度，腫瘤新生血管的數(shù)量及新生血管的成熟度等三大特點，提出間質(zhì)微環(huán)境特征分子分型概念，據(jù)此將胃癌分為4種亞型，各組間的臨床預(yù)后具有顯著差異［24］。并且，不同的胃癌病理類型呈現(xiàn)的腫瘤微環(huán)境差異顯著，由浸潤性巨噬細(xì)胞、腫瘤新生血管及腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的轉(zhuǎn)移單元在低分化胃癌中顯著多于高分化胃癌［25］。

另外，基于量子點多分子成像技術(shù)的肝細(xì)胞癌微環(huán)境研究結(jié)果顯示，Ⅳ型膠原在腫瘤組織中分布具有異質(zhì)性，并根據(jù)間質(zhì)微環(huán)境差異總結(jié)出以下三方面特征［8］：1）相比于癌旁及肝硬化組織，肝癌細(xì)胞外間質(zhì)中的主要成分Ⅳ型膠原由于機(jī)械應(yīng)力的作用變得僵直并且缺乏彈性；2）膠原在降解之前，將發(fā)生壓縮和重塑，與腫瘤新生血管的形成同時進(jìn)行；3）膠原在侵襲的前鋒部位被降解，而剩余的未被降解部位的膠原呈線性排列，圍繞著癌巢與血管。上述工作表明，在開展腫瘤分子分型時，既要關(guān)注腫瘤細(xì)胞本身，也要分析間質(zhì)微環(huán)境，后者的類型特征是腫瘤預(yù)后預(yù)測體系的必要部分。

圖2 癌癥侵襲過程中腫瘤微環(huán)境的5種組織學(xué)特征Figure 2 Five histopathologic characteristics of tumor microenvironment during tumor invasion

4 結(jié)語

腫瘤是多基因參與的復(fù)雜疾病，具有多階段性發(fā)展的特點［8］。因此腫瘤研究模式也必須不斷發(fā)展：從單基因向多基因、從單一層次向集成層次、從單種細(xì)胞向多種細(xì)胞轉(zhuǎn)變，多維信息的獲取和分析技術(shù)則是實現(xiàn)這一轉(zhuǎn)變的先決條件。量子點標(biāo)記探針多色成像技術(shù)和多光譜分析技術(shù)，為基于多分子差異表達(dá)的腫瘤分子分型提供了較好的平臺，有望在指導(dǎo)腫瘤個體化治療方面發(fā)揮重要作用。

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（2013-09-27收稿）

（2013-11-15修回）

Research progress on the molecular classification of tumors by quantum dot-based nanotechnology

Min FANG1,Chunwei PENG1,Chuang CHEN2,Daiwen PANG3,Yan LI1

Yan Li;E-mail:liyansd2@163.com
1Department of Oncology,Zhongnan Hospital of Wuhan University,Hubei Key Laboratory of Tumor Biological Behaviors and Hubei Cancer Clinical Study Center,Wuhan 430071,China.
2Department of Breast and Thyroid Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China.
3College of Chemistry and Molecular Sciences,Wuhan University,Wuhan 430072,China.

Malignant tumors are highly heterogeneous in terms of molecular phenotypes such that personalized therapy will become the standard for tumor therapy.Molecular classifications of cancer based on differences in biological behavior are important for selecting treatment strategies and prognostication.The unique optical and chemical properties of quantum dots have been widely used in biomedical applications such as tumor diagnosis,monitoring,pathogenesis,treatment,molecular pathology,and heterogeneity based on biological markers.In this study,we discuss the application of quantum dot-based nanotechnology and the molecular classification of cancer in personalized oncology.

quantum dots,tumor,molecular classification,multiplexed imaging

10.3969/j.issn.1000-8179.20131857

①武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤科，湖北省醫(yī)學(xué)臨床研究中心，腫瘤生物學(xué)行為湖北省重點實驗室（武漢市430071）；②武漢大學(xué)人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外科；③武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院

*本文課題受國家自然科學(xué)基金面上項目（編號：81171396）、重點項目（編號：81230031/H18）和國家科技重大專項（編號：2012ZX10002012-12）資助

李雁 liyansd2@163.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81171396,81230031/H18)and the National Science and Technology Major Project(No.2012ZX10002012-12).

（本文編輯：鄭莉）