陳鳳萍，吳 霖，沈 巖，許 琪

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京100005

精神分裂癥是一種病因尚未完全闡明的復(fù)雜疾病，人群中的終生患病率為 1%［1-2］，遺傳度約為81%［3］。目前已發(fā)現(xiàn)了許多相關(guān)基因，例如:乙醛脫氫酶2基因 (aldehyde dehydrogenase 2 gene，ALDH2)、兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因 (catechol-O-methyltransferase gene，COMT)、多巴胺D4受體基因 (dopamine receptor D4 gene，DRD4)等［4］。精神分裂癥的發(fā)生有多種假說［5］，其中多巴胺假說被廣泛接受［6］。膽囊收縮素 (cholecystokinin，CCK)廣泛存在于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)［7］，一般與多巴胺同時存在，調(diào)節(jié)其釋放及其相關(guān)行為［8］。膽囊收縮素受體A基因 (cholecystokinin A receptor gene，CCKAR)是 CCK的 A型受體［9］。CCKAR基因位于4p15.2-15.1，表達膽囊收縮素受體A。Wei等［10］研究發(fā)現(xiàn)，位于 CCKAR基因中的rs1800857位點可能與精神分裂癥相關(guān)，并多次被證實［11-12］。通過持續(xù)研究，多個位點被證實與精神分裂癥相關(guān)，如:rs1800908、rs1799723等［13］。本研究通過對CCKAR基因進行深度測序，尋找了CCKAR基因中其他與精神分裂癥相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism，SNP)位點或罕見變異位點。

對象和方法

對象及分組2008年12月至2009年2月在東北招募的精神分裂癥患者8例 (病例組)和正常對照者8名 (對照組)。病例組8例患者中，男5例，女3例，平均年齡 (37.6±2.9)歲 (27～46歲)，均經(jīng)過2名副主任以上醫(yī)師采用精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊(Diagnostic and Statistical Manual of Mental DisordersⅣ，DSM-Ⅳ)檢查確診入院。同時應(yīng)用DSM-Ⅳ定式臨床會談量表 (Structured Clinical Interview for DSM-Ⅳ，SCID)作為標(biāo)準(zhǔn)化臨床診斷工具。實施診斷的醫(yī)師經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)并在實驗前進行診斷一致性檢驗，保證了入組對象的同質(zhì)性。對照組8名受試者中，男3名，女5名，平均年齡 (34.6±4.9)歲 (24～54歲)，均招募自當(dāng)?shù)厣鐓^(qū)，排除有精神或神經(jīng)系統(tǒng)疾病家族史的個體。所有實驗樣本均來自北方漢族人群，獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，均簽署知情同意書。

DNA提取基因組DNA主要由酚-氯仿抽提方法或采用DNA提取試劑盒 ［Flexi Gene DNA Kit(250)，美國QIAGEN公司］從個體的全血中提取，從1 ml全血中提取DNA之后將DNA樣本儲存至4℃。

CCKAR基因區(qū)域捕獲測序采用Haloplex目標(biāo)富集系統(tǒng) (美國Agilent公司)對包括CCKAR基因(chr4:26483018-26492042)在內(nèi)的一段區(qū)域 (chr4:26470000-26500000)的DNA序列進行捕獲測序。捕獲的步驟如下:(1)采用限制性內(nèi)切酶降解基因組DNA;(2)已降解的DNA與Haloplex探針在目標(biāo)區(qū)域上雜交;(3)捕獲目的DNA;(4)結(jié)束捕獲，環(huán)化片段;(5)準(zhǔn)備PCR預(yù)混液;(6)用NaOH洗脫捕獲到的DNA;(7)PCR擴增目的文庫;(8)純化擴增到的目的文庫;(9)驗證富集物及量化富集到的目的DNA;(10)用不同的指標(biāo)對樣本進行組合分析。

統(tǒng)計學(xué)處理采用IGV軟件查看測序結(jié)果，去除結(jié)果中的假陽性位點 (僅處在片斷邊緣的突變位點即為假陽性)，以免影響后期的分析。對確定為陽性的位點采用Unphased 2.0軟件進行分析，獲得OR值，分析測序得到的陽性位點是否與精神分裂癥相關(guān)。

結(jié) 果

通過測序 CCKAR基因獲得的插入/缺失位點(in/del)為 16個 (13.68%)，SNP位點為 75個(64.10%)，新發(fā)現(xiàn)的未知位點 (即不存在于NCBI數(shù)據(jù)庫中的位點，暫命名為None)為10(8.55%)。對該區(qū)域深度測序，芯片覆蓋度約為94.26%，平均測序深度達115.09。

采用IGV2.3軟件查看測序結(jié)果，去除測序得到的117個位點中的14個 (11.96%)假陽性位點，這些假陽性位點均為None位點。去除假陽性位點后，在該區(qū)域內(nèi)所檢測到的位點，有30個位于CCKAR基因上，包括:5個 (4.27%)插入/缺失位點、22個(18.80%)SNP位點和3個 (2.56%)None位點。

采用Unphased軟件分析檢測到的位于CCKAR基因的SNP位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個較有意義的位點——rs191275118，該位點在病例組樣本中出現(xiàn)的次數(shù)是2，在對照組樣本中的出現(xiàn)次數(shù)為0(表1)。根據(jù)NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫顯示，rs191275118位于CCKAR基因第3內(nèi)含子，主等位基因為A，次等位基因為G，其次等位基因頻率 (minor allele frequency，MAF)值為0.002。在CCKAR基因中檢測到的3個未在NCBI數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)的變異位點為 chr4:26485259、chr4:26487139、chr4:26488302，其在病例組樣本中出現(xiàn)的次數(shù)均為0，在對照組樣本中出現(xiàn)的次數(shù)均為1，OR值為0。

表1 SNPs discovered from deep sequencing in CCKAR gene regionTable 1 通過深度測序在CCKAR基因內(nèi)發(fā)現(xiàn)的SNP位點

討 論

精神分裂癥是典型的多基因復(fù)雜疾病，由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用［14］。其中，遺傳因素發(fā)揮著重要的作用。目前已報道的有關(guān)精神分裂癥的關(guān)聯(lián)研究有1727項，可能的易感基因1008個，多態(tài)性位點8788個，以及287個薈萃分析報道 (截止到2014年2月28日，http://www.schizophreniaforum.org/res/sczgene/default.asp)。CCKAR基因是這其中一個重要的與精神分裂癥相關(guān)的基因。近幾年來對CCKAR基因的研究很多，但是結(jié)果復(fù)雜多樣，且重復(fù)性較差。

遺傳異質(zhì)性是精神分裂癥遺傳學(xué)研究中一個重要的干擾因素，也是眾多復(fù)雜疾病研究的障礙之一，往往使復(fù)雜疾病的研究變得比較困難。本研究希望能夠通過對CCKAR基因的深度測序，尋找精神分裂癥發(fā)病中與CCKAR相關(guān)的變異位點，從而確定可能是由于某一位點的影響或是這些位點共同作用導(dǎo)致了與CCKAR相關(guān)的精神分裂癥的發(fā)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個可能與精神分裂癥相關(guān)的變異位點——rs191275118，位于CCKAR基因的第3內(nèi)含子。rs191275118的MAF值為0.002，屬于罕見變異位點 (一般認(rèn)為，MAF＜1%的變異位點為罕見變異［15］)。目前還幾乎沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于CCKAR基因中rs191275118位點的報道，提示rs191275118可能是一個新發(fā)現(xiàn)的CCKAR基因中與精神分裂癥的相關(guān)位點。同時，因為這一位點是一個低頻突變位點，可能會對“常見疾病-罕見變異 (common-disease rare variation，CDRV)”的假說起到部分支持作用。本研究屬于對CCKAR基因及該位點的初步研究，從實驗結(jié)果看來，該位點具有一定的研究意義，值得深入研究?？梢岳么髽颖緦@個位點進行驗證，證實rs191275118與精神分裂癥的相關(guān)性。

本研究中未發(fā)現(xiàn)該區(qū)域中與精神分裂癥相關(guān)的未知變異位點。但是，并不證明在CCKAR基因中不存在與精神分裂癥相關(guān)的未知變異。推測原因可能是這些位點的頻率過低或信號較小不容易被檢測到;或是由于二代測序中芯片的覆蓋度不能達到100%，一些突變位點未能被檢測到，這有待于技術(shù)層面的提升。

綜上，本研究雖然仍存在一些缺陷，但發(fā)現(xiàn)了CCKAR基因中可能與精神分裂癥相關(guān)的新的變異位點，若其他研究中對這一位點進行后續(xù)的研究及分析，可能會發(fā)現(xiàn)更多的信息，對CCKAR基因的相關(guān)資料具有補充作用。

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