廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州 510130

不同劑量痰熱清對(duì)急性肺損傷大鼠肺勻漿內(nèi)炎癥因子的影響

林宏范小紅陳群雄張智琳

廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州 510130

目的觀(guān)察不同劑量痰熱清對(duì)ALI大鼠肺勻漿內(nèi)炎癥因子的影響。方法雄性Wistar大鼠72只，隨機(jī)分為4組，包括正常對(duì)照組(A組)、ALI模型組(B組)、常規(guī)劑量組(C組)、高劑量組(D組)，每組18只。后三組大鼠經(jīng)尾注射脂多糖復(fù)制ALI模型。30min后經(jīng)腹腔注射生理鹽水、2.1ml/kg與4.2ml/kg的痰熱清，每天給藥1次，連續(xù)3d。每次給藥后6h將每組的6只大鼠處死，取肺組織制成肺勻漿，檢測(cè)MMP-9、 TNF-α、IL-6含量，并在光鏡下觀(guān)察肺組織病理變化。結(jié)果C、D兩組與B組相比，肺勻漿MMP-9、TNF-α、IL-6含量有顯著下降(P<0.05或P<0.01)， C、D兩組之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而D組大鼠出現(xiàn)不良反應(yīng)和死亡的情況較C組多。光鏡下B組呈現(xiàn)ALI病理改變， C、D兩組較B組有明顯改善，兩組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論痰熱清可以降低ALI大鼠肺勻漿內(nèi)的炎癥因子水平，常規(guī)劑量和高劑量效果相當(dāng)，但高劑量可能會(huì)導(dǎo)致不良反應(yīng)增加。

急性肺損傷；痰熱清注射液；大鼠；炎癥因子

Ashbaugh于1967年首次對(duì)急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)進(jìn)行了報(bào)道，雖然是臨床常見(jiàn)的嚴(yán)重性呼吸急癥，但目前臨床尚未明確其發(fā)病機(jī)制，有資料顯示多種炎癥因子在其發(fā)病過(guò)程中起重要作用。臨床治療上，西醫(yī)尚無(wú)特異療法，多給予液體復(fù)蘇、呼吸管理、原發(fā)病治療及感染控制治療。

祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)雖然沒(méi)有關(guān)于急性肺損傷的記載，但根據(jù)急性肺損傷的臨床癥狀，應(yīng)當(dāng)屬于“喘證、喘脫、暴喘”范疇。既往研究表明，中醫(yī)藥治療急性肺損傷尚有一定療效[1]。痰熱清注射液是金銀花、黃岑、連翹、羚羊角及熊膽粉等組成的中成藥，有清熱解毒、化痰解痙的作用，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)痰熱清注射液對(duì)炎癥因子有降低作用，可以減輕患者炎癥反應(yīng)，對(duì)肺部病理改變進(jìn)行改善，對(duì)ALI有一定療效[2]。本研究采取連續(xù)給藥3d的治療方式，對(duì)比觀(guān)察不同劑量下痰熱清對(duì)急性肺損傷大鼠肺勻漿液MMP-9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)、TNF-α(腫瘤壞死因子α)、IL-6(白細(xì)胞介素6)水平的影響，統(tǒng)計(jì)不良發(fā)應(yīng)，現(xiàn)具體報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 研究選用的動(dòng)物為中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的雄性SPF級(jí)Wistar大鼠，共72只，體重180～220g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 選取美國(guó)Rapidbio(RB)公司的ELISA試劑盒作為MMP-9試劑盒。

1.3 分組實(shí)驗(yàn)方法 將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為四組：A組(正常組)，B組(急性肺損傷模型組)，C組(常規(guī)劑量組)，D組(高劑量組)，每組各18只。

1.4 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?A組大鼠經(jīng)尾靜脈注射2ml/kg的生理鹽水，B、C、D三組均靜注5mg/kg脂多糖復(fù)制AIL模型。0.5h后經(jīng)腹腔注射藥物，A組生理鹽水、B組生理鹽水、C組2.1ml/kg痰熱清(上海凱寶藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030054，20ml/支)、D組4.2ml/kg痰熱清。每天早上注射1次，連續(xù)3d。所有大鼠用藥劑量均按人的臨床用藥劑量折算。

1.5 實(shí)驗(yàn)取樣 每次注射6h后，每組隨機(jī)選取6只大鼠經(jīng)腹腔注射0.3ml/100g的10%水合氯醛進(jìn)行麻醉(注：A組第1d處死的大鼠為A1組，B組第1d處死的大鼠為B1組，A組第2d處死的大鼠為A2組，以此類(lèi)推)，大鼠麻醉后行股動(dòng)脈放血處死，開(kāi)胸取1cm×1cm×1cm左肺中葉組織塊，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片后HE染色，經(jīng)光鏡對(duì)其形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行觀(guān)察。另開(kāi)胸取右肺中葉1g，加入9ml生理鹽水，冰浴中勻漿30秒，于4攝氏度下3500rpm離心0.5h，取離心后上清液分裝凍存，以此作為嚴(yán)重指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 檢測(cè)方法 應(yīng)用ELISA法對(duì)大鼠肺勻漿MMP-9、TNF-α、IL-6水平進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠死亡情況 B組第1天死亡1只。C組第2天死亡1只。D組第1、2、3天各死亡1只。B、C組死亡率為5.6%，D組為16.7%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，D組大鼠大部分大便稀溏、次數(shù)增多。

2.2 各組大鼠肺勻漿的MMP-9、TNF-α、IL-6含量分別見(jiàn)表1、表2和表3。

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05。

表2 各組大鼠TNF-α水平(ng/l)

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05，##P<0.01;與B1比較，△P<0.05;與C1比較，☆P<0.05；與D1比較，▲P<0.05。

表3 各組的IL-6含量(ng/L)

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05，##P<0.01;與C1比較，△P<0.05。

2.3 光鏡下肺組織病理改變情況 A組：大鼠肺組織呈粉紅色，表面完整且光滑，可見(jiàn)完整的肺泡與支氣管組織。

B組：大鼠肺組織表面有分?jǐn)?shù)的點(diǎn)、片狀出血壞死灶，標(biāo)本切面有大量粉紅色液體溢出，光鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)肺間質(zhì)有充血、水腫癥狀，肺泡間隔增寬，肺毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，肺泡部分融合，肺泡腔內(nèi)、肺間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，多中性粒細(xì)胞，少量淋巴細(xì)胞，有局灶性紅細(xì)胞滲出。

C組：大鼠肺組織表面與B組大鼠相同，但范圍小于B組。C1組大鼠光鏡下實(shí)變范圍、炎性細(xì)胞顯著減少，肺泡內(nèi)滲出性紅細(xì)胞無(wú)減少。C2組大鼠光鏡下肺實(shí)變范圍減少明顯，肺泡內(nèi)滲出性紅細(xì)胞少量增多。C3組大鼠光鏡下肺實(shí)變范圍、炎性細(xì)胞、滲出紅細(xì)胞均少于其他兩組。

D組：大鼠肺組織表面同B組。光鏡下肺實(shí)變范圍與C組相似，肺間質(zhì)有充血、水腫癥狀，肺泡腔內(nèi)、肺間質(zhì)多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，多中性粒細(xì)胞，無(wú)成堆分布，局灶性紅細(xì)胞滲出。D1～D3組病變依次減輕，其中D2、D3組細(xì)支氣管、血管旁肥大細(xì)胞較多。

3 討論

MMP-9是MMPs家族中重要的成員，是Ⅳ型膠原，主要分解基底膜，是構(gòu)成毛細(xì)血管內(nèi)皮及肺泡上皮細(xì)胞基底膜的主要成分，在基底膜損傷中有重要意義[3]。臨床多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，痰熱清可對(duì)急性肺損傷大鼠的肺泡灌洗液MMPs活性進(jìn)行誘導(dǎo)以促使其升高，而且MMP-2與MMP-9的活性變化與肺病理形態(tài)學(xué)積分顯著相關(guān)，并對(duì)肺間質(zhì)及肺泡水腫的形成有促進(jìn)作用，對(duì)痰熱清誘導(dǎo)的過(guò)程中有重要意義[4]。TNF-α是早期主要的前炎癥因子之一，它主要通過(guò)直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞、激活中性粒細(xì)胞聚集、抑制肺表面活性物質(zhì)的形成等途徑參與ALI的發(fā)生與發(fā)展[5]。ALI/ARDS患者的血液與肺部中IL-6水平均明顯高于健康人群，研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，ALI大鼠肺勻漿與血漿中IL-6水平顯著升高，與肺損傷病變程度呈正相關(guān)[6]。

本研究結(jié)果表明，C組與D組大鼠指標(biāo)均于B組差異顯著，說(shuō)明常規(guī)劑量的痰熱清與大劑量痰熱清對(duì)肺MMP-9、IL-6及TNF-α均有降低作用，且效果無(wú)明顯差異，各組的病理切片亦呈相應(yīng)改變，這與我們之前的相關(guān)研究結(jié)果一致[7]。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，C2組與C1組大鼠TNF-α水平差異顯著(P<0.05)，D3組與D1組大鼠TNF-α水平差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明連續(xù)注射2～3d，大鼠TNF-α水平較第1d下降顯著，但而MMP-9與IL-6均未出現(xiàn)類(lèi)似TNF-α的變化，可能由于TNF-α作為早期前炎癥因子，是炎性反應(yīng)中釋放最早且最重要的內(nèi)源性介質(zhì)[8]。說(shuō)明痰熱清早期應(yīng)用對(duì)抑制早期體內(nèi)TNF-α水平、減輕炎癥反應(yīng)對(duì)肺部損害有重要作用。

研究結(jié)果還表明，D組大鼠有腹瀉癥狀，組內(nèi)死亡大鼠數(shù)量均高于B組與C組。相關(guān)研究資料表明，痰熱清臨床應(yīng)用不良反應(yīng)中，消化系統(tǒng)不良反應(yīng)高達(dá)15.8%，5.3%表現(xiàn)為過(guò)敏性休克，部分嚴(yán)重患者有喉頭水腫的癥狀[9]。所以應(yīng)注意高劑量痰熱清引發(fā)不良反應(yīng)的現(xiàn)象。

綜上所述，本研究使我們發(fā)現(xiàn)常規(guī)劑量與高劑量痰熱清對(duì)肺部炎癥因子有降低作用，可以減輕肺部炎癥癥狀，但值得注意的事高劑量痰熱清應(yīng)用的不良反應(yīng)與死亡率偏高，臨床應(yīng)進(jìn)一步關(guān)注研究。

[1]梁迪思，張智琳，江桂英，等.不同劑量痰熱清注射液對(duì)急性肺損傷大鼠白細(xì)胞介素-6的影響[J].廣東醫(yī)學(xué)，2013,34(8)：1170-1172.

[2]陳昊，張麗葳，李文放，等.不同劑量烏司他丁對(duì)急性肺損傷大鼠MMP-9等炎癥因子調(diào)控的研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011,8(24)：15-18,25.

[3]常龍海，劉志群，范文昌，等.中藥對(duì)急性肺損傷保護(hù)的藥理作用及研究進(jìn)展[J].臨床合理用藥雜志，2012,5(33)：153-154.

[4]閆龍，黃小民.痰熱清注射液對(duì)急性肺損傷大鼠保護(hù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2011,20(4)：587-589.

[5]吳海青，李濤平，徐健，等.間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠親環(huán)素A表達(dá)的影響[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2012,39(5)：425-429.

[6]黃繼義，劉才文，林建東，等.TOLL樣受體4對(duì)脂多糖致急性肺損傷大鼠炎癥因子的影響[J].西南國(guó)防醫(yī)藥，2014,24(1)：23-26.

[7]張智琳，周麗梅，江沂，等. 清熱化痰法對(duì)急性肺損傷大鼠干預(yù)作用的研究[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29(12)：1913-1915.

[8]莊先飛，俞蘇嵐，樊夢(mèng)霖.中藥復(fù)方防治急性肺損傷的作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012,18(17)：326-331.

[9]李昌達(dá)，高東艷.鹽酸戊乙奎醚預(yù)先給藥對(duì)鹽酸所致大鼠急性肺損傷時(shí)LXR-α表達(dá)的影響[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012,18(13)：22-23.

廣州市中醫(yī)藥科技項(xiàng)目,項(xiàng)目編號(hào):20122A011008。

R285.5

A

1007-8517(2014)15-0017-02

2014.06.16)