薛瑞 孫靜 劉潔瓊 寧夏藥品檢驗(yàn)所（銀川 750004）

白毛七來(lái)源于金粟蘭科植物銀線草（Chloranthus japonicus sieb）、多穗金粟蘭（Chloranthus multistachys Pei）、寬葉金粟蘭（Chloranthus henryi Hemsl）以及絲穗金粟蘭（Chloranthus fortune Solms）的干燥根及根莖，全株供藥用，具有祛濕散寒、活血止痛、散瘀解毒的功效[1]。金粟蘭屬植物在我國(guó)主要分布在東北、河北、山西、陜西、甘肅等省區(qū)[2]。銀線草為白毛七主要藥源之一，早在民間就有廣泛的應(yīng)用，全草根莖可供藥用，如《陜西中草藥》記載銀線草：“祛濕散寒，理氣活血，散疲解毒。主治勞傷，腰腿疼，跌打損傷，感冒等”，《長(zhǎng)白山藥用植物志》記載：“主治風(fēng)寒咳嗽，無(wú)名腫毒，皮膚瘙癢”等等[3]。但有關(guān)該藥材在活血化瘀作用及其有效部位的研究領(lǐng)域?yàn)榭瞻?，植物開發(fā)應(yīng)用方面很成功，但其基礎(chǔ)研究薄弱，有效成分不清楚，作用機(jī)理不明確。為了明確白毛七活血化瘀的作用，為臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本研究對(duì)其活血化瘀作用及有效部位進(jìn)行比較研究。

1 材料和方法

1.1 動(dòng) 物 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體重180g±20g；SPF級(jí)昆明小鼠，20±2g，雌雄各半，由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（陜）2007-001。

1.2 藥物和試劑

1.2.1 藥材：白毛七藥材購(gòu)自秦嶺太白縣，經(jīng)本院王繼濤教授鑒定為該藥材來(lái)源于金粟蘭科（Chloranthaceae）植物銀線草（Chloranthus japonicus sieb）干燥根及根莖。

1.2.2 水提物：稱取白毛七藥材20g，12倍量水浸泡30min，回流提取3次，每次2h，合并提取液濃縮，分別配成分別配成原藥材含量為0.2g／mL（小鼠劑量）和1.0g／mL（大鼠劑量）的溶液。

1.2.3 醇提物：稱取白毛七藥材20g，12倍量70%乙醇浸泡30min，加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液回收乙醇只無(wú)醇味，加少量水，分別配成分別配成原藥材含量為0.2g／mL（小鼠劑量）和1.0g／mL（大鼠劑量）的溶液。

1.2.4 系統(tǒng)溶劑法各提取物：稱取白毛七藥材100g，依次用8倍量石油醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇提取，提取3次，每次2h，合并各部位提取液，回收溶劑濃縮，加適量0.5%CMC-Na蒸餾水溶液研磨配置成混懸液，分別配成原藥材含量為0.2g／mL（小鼠劑量）和1.0g／mL（大鼠劑量）的溶液。記作石油醚提取部位、氯仿提取部位、乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位。

1.2.5 主要試劑：銀杏葉片（江蘇晨牌藥業(yè)有限公司，批號(hào)110101），使用時(shí)取銀杏葉片適量，研成粉狀，用80%乙醇溶液超聲提取2次，每次30min，濃縮，加入適量蒸餾水，分別配成原藥含量為0.125片／mL（小鼠劑量）和0.046片／mL（大鼠劑量）的溶液。鹽酸腎上腺素（上海合豐制藥有限公司，批號(hào)101201）。烏拉坦。凝血酶原時(shí)間（PT）測(cè)定試劑盒（上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)202106）。所用試劑均為分析純。

1.3 儀 器 YLS-14B動(dòng)物血栓生成儀（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站）；AR-1140型電子天平（梅特勒－托利多（上海）有限公司制造）；KH-400KDE超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠出、凝血時(shí)間及凝血酶原時(shí)間的測(cè)定[4－7]：取80只小鼠，體重20±2g，雌雄各半，隨機(jī)分為8組，每組10只。分別記為醇提組、水提組、石油醚組、氯仿組、乙酸乙酯組、正丁醇組、陽(yáng)性組和空白組。適應(yīng)性飼養(yǎng)5d后，除空白組和模型組灌等體積生理鹽水，其余每組按0.4mL／d／只進(jìn)行灌胃給藥，連續(xù)給藥7d。末次給藥后1h后，用手術(shù)剪于尾尖1.5mm處剪斷尾，待血液自行溢出開始計(jì)時(shí)，每間隔30s用濾紙吸去血滴1次，直至血流自然停止，記為出血時(shí)間。小鼠摘眼球取血，置于含有0.109mol／L枸櫞酸鈉抗凝液的子彈頭中，輕輕點(diǎn)到混勻，3000rpm離心15min，收集上層液，取待測(cè)血漿0.1mL，37℃孵育3min，加入37℃預(yù)溫PT試劑0.2mL，輕輕振搖，并對(duì)光觀察，測(cè)定出現(xiàn)果凍樣狀態(tài)的時(shí)間，記為凝血酶原時(shí)間。同時(shí)取一滴血，使血滴于玻片上，立即按下秒表計(jì)時(shí)，每隔20～30s用針頭挑血一次，直至出現(xiàn)絲狀血塊，停表記錄為凝血時(shí)間。

1.4.2 大鼠凝血時(shí)間和血栓的測(cè)定[8－9]：取雄性SD大鼠50只，體重200±20g，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，記為正丁醇組、乙酸乙酯組、陽(yáng)性組、模型組和空白組。適應(yīng)性飼養(yǎng)5d后，除空白組和陽(yáng)性組灌等體積生理鹽水，其余組均按4mL／d／只劑量進(jìn)行灌胃給藥，連續(xù)灌胃給藥7d后禁食不禁水12h，第8d除空白組外，其余各組大鼠皮下注射鹽酸腎上腺素（Adr）（10μg／mL）兩次0.08mL／100g，間隔4h，在兩次注射Adr之間將大鼠浸入冰水內(nèi)5min，造成急性血瘀模型。造模后，大鼠頸總動(dòng)脈取血，當(dāng)血液自行流出后，將血滴滴于載玻片，立即開始計(jì)時(shí)，伺候每隔5～10s用干燥的針頭挑動(dòng)血滴1次，至針頭挑起纖維蛋白絲為止，即為凝血時(shí)間。大鼠頸總動(dòng)脈取血，讓血液直接流入人造血管里，人造血管兩接頭插緊，放入儀器內(nèi)，啟動(dòng)開關(guān)，10mins，37℃條件下，一起報(bào)警聲響后去出，將人造血管里的血均勻?qū)г跒V紙上，稱重，1d后，再稱量血栓干重。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 小鼠出、凝血時(shí)間及凝血酶原時(shí)間 結(jié)果見表1，顯示醇提部位和正丁醇部位能顯著延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間，乙酸乙酯提取部位有一定延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽(yáng)性組和空白組對(duì)照組均有極顯著性差異（P＜0.01）。各提取部位與空白組比較，正丁醇提取部位能顯著延長(zhǎng)小鼠的凝血時(shí)間和出血時(shí)間（P＜0.05），乙酸乙酯提取部位有顯著延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間的作用，醇提部位和正丁醇提取物能明顯延長(zhǎng)小鼠的凝血時(shí)間（P＜0.05），且正丁醇部位效果優(yōu)于醇提部位活血作用。水提部位、石油醚部位和氯仿提取部位與空白對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異，可判斷該部位沒(méi)有活血化瘀的作用，且白毛七活血化瘀物質(zhì)極性偏小，易溶于有機(jī)溶劑。

表1 各提取部位對(duì)小鼠凝血時(shí)間、出血時(shí)間和凝血酶原時(shí)間的影響（，n＝10）

表1 各提取部位對(duì)小鼠凝血時(shí)間、出血時(shí)間和凝血酶原時(shí)間的影響（，n＝10）

注：與空白組比較△P＜0.05，▲P＜0.01

分組 凝血時(shí)間（s） 出血時(shí)間（min） 凝血酶原時(shí)間（s）132±26.09 10.73±1.78 11.41±0.65陽(yáng)性組 198±25.97▲ 14.10±1.93▲ 12.91±0.94▲水提組 143±29.01 11.86±1.75 11.10±0.82醇提組 165±21.89▲ 12.45±1.47△ 12.07±0.63△石油醚組 137±29.29 11.32±1.42 11.09±0.59氯仿 144±25.25 11.87±1.41 10.79±0.86乙酸乙酯組 167±32.43△ 12.17±1.72 11.06±0.82正丁醇組 163±15.26△ 12.75±1.11▲ 12.28±0.99空白組△

2.2 大鼠凝血時(shí)間和抗血栓形成實(shí)驗(yàn) 結(jié)果見表2，顯示正丁醇部位有顯著的抗血栓形成的作用。

表2 各提取部位對(duì)大鼠活血化瘀作用的影響（，n＝10）

表2 各提取部位對(duì)大鼠活血化瘀作用的影響（，n＝10）

注：與空白組比較△P＜0.01，與模型組比較▲P＜0.01

分組 凝血時(shí)間（s） 血栓濕重－干重（g）18.2±1.69 1.1107±0.0342模型組 14.7±2.54△ 1.3014±0.6622△陽(yáng)性組 22.2±4.87▲ 1.0646±0.0385▲正丁醇組 20.9±2.60▲ 1.0829±0.8111▲乙酸乙酯組空白組17.2±7.65 1.19241±0.0849

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組指標(biāo)與空白對(duì)照組有極顯著性差異（P＜0.01），表明鹽酸腎上腺素和冰水刺激引起的寒凝血瘀證大鼠模型建立成功。與模型組比較，正丁醇提取物能顯著延長(zhǎng)急性血瘀模型大鼠的凝血時(shí)間，有明顯抗血栓形成的作用（P＜0.01），乙酸乙酯提取物與模型組比較無(wú)顯著性差異。

3 討 論 血液流變學(xué)在宏觀上是研究血液與血漿的流變性質(zhì)，比如血液粘度、血漿粘度與剪切率的關(guān)系，凝血與血栓形成等[10]。而在中醫(yī)藥的使用歷史上，活血化瘀中藥主要具有改變血液流變學(xué)、血流動(dòng)力學(xué)、血小板功能、調(diào)節(jié)血脂以及抗凝血等作用。

考慮實(shí)驗(yàn)成本等因素，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用系統(tǒng)溶劑法，先以小鼠出血、凝血時(shí)間和凝血酶原時(shí)間為考察指標(biāo)，初步篩選出白毛七具有活血化瘀作用的部位，再根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，以大鼠凝血時(shí)間及體外血栓質(zhì)量為考察指標(biāo)，進(jìn)一步篩選白毛七活血化瘀有效部位，結(jié)果顯示正丁醇提取部位有抗血栓形成的作用，因此初步可認(rèn)為正丁醇部位所含的主要成分是白毛七活血化瘀的主要有效成分。但白毛七正丁醇提取部位的有效成分還有待進(jìn)一步研究。

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