郭新榮 王瑞輝 吳 濤 史海龍 屈紅艷 陜西中醫(yī)學院(咸陽 712046)
NGF(nerve growth factor,NGF)是最早發(fā)現的典型的神經營養(yǎng)因子、研究最為廣泛、最深入,其在神經細胞的發(fā)育、軸突的生長及遞質的合成和細胞的凋亡等多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要的調控作用[1]。NGF能促進外周及中樞神經元的分化、生長和存活,在維持大腦正常的生理功能中發(fā)揮著極其重要的調節(jié)作用[2]。本研究旨在觀察針刺不同時間干預治療TBI的效果,選用NGF作為觀察指標。
1 材料及方法
1.1 動物及分組 實驗大鼠(批號:20121023)由西安交通大學實驗動物中心提供,體重220~240g,適應性飼養(yǎng)3d,隨機分為空白(A)、針刺1(B)、針刺2(C)、針刺3(D)和模型(E)組。
1.2 主要實驗儀器設備及試劑 全自動脫水機(ZT-12J)、切片機(JJQ-P2016J,均湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司);包埋機(JB-L6,武漢俊杰電子有限公司);冷凍高速離心機(德國eppendorf centrifuge 5417R);PH酸度計德國((Sartorius PB-10),賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);微型脫色搖床(TY-80S型,南京新校園生物技術研究所);電泳槽(美國 BIO-RAD;轉印槽(美國BIO-RADMini Trans-Blot?Cell);NanoDrop微量核酸定量儀(Thermo Fisher Scientific,Inc);熒光定量PCR設備(美國伯樂IQ5)。
TransScript All-in-One First-Strand Cdna Synthesis Super Mix for qPCR試劑盒、TransStar Top Green qPCR SuperMix試劑盒(均北京全式生物技術有限公司)引物合成(由南京金斯瑞生物科技有限公司提供);BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司);Blue Plus II Protein Marker(14KDa-100KDa)、Anti-β-actin Mouse Monoclonal Antibody、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),HRP Conjugate、Goat Anti-Mouse IgG(H+L),HRP Conjugate(均北京全式生物技術有限公司);NGF beta Rabbit Monoclonal Antibody(美國 EPITMICS公司);ECL Plus熒光檢測試劑盒(MILLIPORE);Rabbit Anti-NGF一抗、兔源二抗IgG-兔免疫組化試劑盒SABC即用型、DAB顯色試劑盒(均武漢博士德生物工程有限公司)。
1.3 TBI模型制備 術前禁食8h。實驗時腹腔內注射2%的戊巴比妥鈉(75mg/kg)進行麻醉,俯臥位固定于腦立體定向儀上。消毒皮膚,正中切開,剝離骨膜 ,暴露右頂骨,用微型磨鉆在冠狀縫后3mm、中線右旁2.5mm處鉆一直徑為2mm的骨窗,保持硬膜完整。將大鼠移置到電子顱腦損傷儀(eCCI-6.3,美國VCU大學設計)操作臺上,調試好機器參數(打擊速度4m/s、深度3mm),對B、C、D和E組動物全部進行打擊,撞擊桿撞擊硬膜,使腦組織產生瞬間形變。打擊后向切口內滴注4萬單位硫酸慶大霉素4~5滴 ,骨蠟封閉骨窗 ??p合頭皮,外涂抹紅霉素軟膏。造模后,放回籠中,單獨喂養(yǎng)。
1.4 治療方法 取穴“百會”、“人中”、左側“內關”、“足三里”[3]。定位參照《實驗針灸學》并結合人體同身寸取穴法??瞻捉M、模型組,正常飼養(yǎng);B、C、D組分別于造模后第1、3、5d開始針刺治療,1d1次,連續(xù)10次。操作方法:75%乙醇棉球穴位消毒,選28號0.5寸華佗牌毫針、常規(guī)消毒,百會向前斜刺、人中直刺,內關、足三里直刺,刺入深度均為2~3mm,各穴均行捻轉手法,前后捻轉各360°左右為1次,共捻轉30次啟針。
1.5 實驗檢測 所有動物于造模后第15d取材,分別進行以下檢測:免疫組化:標本經固定后制成4um厚的石蠟切片,采用SABC染色法。光學顯微鏡下觀察切片中組織染色機NGF蛋白表達情況。
Western blot法檢測NGF蛋白含量:取損傷腦組織,過液氮,用高效RIPA提取蛋白、BCA進行蛋白定量。使用5×SDS上樣緩沖液煮沸5min制備10ug/ul樣本,冷卻到室溫,12000轉/分的低溫高速離心機離心5min,取上清4℃冰箱保存供電泳使用;使用12%的分離膠10mL、5%的濃縮膠5mL灌膠,上樣10ul;60V低電壓跑約30min,、90V電泳跑約90min進行電泳;轉膜(400mA,2.0h);5%milk脫色搖床上搖60min;孵一抗冰箱過夜(1:3000);TBST10min×2次、TBS5min×1次,孵二抗(1:5000,常溫3~5h;TBST10min×2次、TBS5min×1次;ECL發(fā)光,5S~45S;X線壓片、顯影、定影。以β-actin作為內參。
定量PCR檢測mRNA含量:取損傷腦組織,過液氮,用Trizol試劑提取總RNA;使用NANO核酸核糖測定儀測定所提取的RNA的濃度,調整RNA的濃度到10ug/ul;反轉錄為DNA(按試劑盒說明操作);利用NANO測定DNA純度、濃度,調整DNA濃度為20ng/ul;熒光定量PCR反應(參考試劑盒說明操作),NGF上游引物:5’>CTTCAGCATTCCCTTGACAC<3’、下游引物:5’>AAGCCTTCCTGCTGAGCACACA<3’,β-actin上游引物:5’>TCATGAAGTGTGACGTGGACATC<3’,下游引物:5’>TGTTGCATTTGCGGGGACGATG<3’,循環(huán)參數:95℃5min預熱,95℃10S、30℃30S、72℃30S共循環(huán)共40次,72℃5min,55℃30S、溫度梯度為0.5℃,溶解曲線(Melt crave)共81各循環(huán)。
1.7 統計學方法 采用SPSS17.0軟件包進行數據分析。
2 結 果
2.1 免疫組化 免疫組化圖片采用陜西中醫(yī)學院分子生物與免疫組化實驗中心Motic images Advanced 3.0圖像分析系統,檢測NGF陽性表達物情況,在400倍光鏡下隨機選擇5個相鄰視野,計算陽性表達細胞數,取5個視野的平均值。
表1 SD大鼠腦皮層NGF蛋白表達的比較()
表1 SD大鼠腦皮層NGF蛋白表達的比較()
注:△與空白組比較P<0.01,▲與模型對照組比較P<0.01,◇與針刺1組比較P<0.01,◆與針刺2組比較P<0.01。下同
組 別 n 8 39.78±10.27針刺1組 8 58.78±12.54▲針刺2組 8 53.43±8.11▲◇針刺3組 8 49.28±9.91▲◇◆模型組 8 30.83±11.31陽性細胞計數空白組△
圖1 各組SD大鼠腦皮層NGF蛋白表達(×200)
2.2 Western-blot法結果 X-RAY圖像結果利用掃描儀掃描成圖片,再利用Kodak Digital Science 1D軟件分別計算NGF和β-actin各條帶的灰度和面積之乘積,最后分別計算出NG與β-actin的比值,即得到各蛋白表達的相對百分含量。各組結果利用()表示。
表2 SD大鼠腦皮層NGF蛋白WB檢測灰度值比較()
表2 SD大鼠腦皮層NGF蛋白WB檢測灰度值比較()
組 別 n 8 7.06±1.28針刺1組 8 14.98±0.85▲針刺2組 8 13.55±1.43▲◇針刺3組 8 12.22±1.04▲◇◆模型組 8 5.55±1.23灰度值空白組△
圖2 腦組織皮質區(qū)NGF蛋白含量的表達
2.3 熒光定量PCR結果 以β-actin的循環(huán)閾值(threshold cycle,CT值定義為每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環(huán)數)作為內參,計算目標基因與內參的差值ΔCT(ΔCT=β-actinCT-target gene CT),數據采用2-ΔCT法計算出mRNA的水平。
表3 腦皮質 NGFmRNA含量的比較(2-ΔCT,)
表3 腦皮質 NGFmRNA含量的比較(2-ΔCT,)
組 別 n 2-ΔCT 6 0.022±0.012針刺1組 6 0.292±0.032▲針刺2組 6 0.175±0.023▲◇針刺3組 6 0.049±0.008▲◇◆模型組 6 0.016±0.010空白組△
3 討 論 中醫(yī)認為,TBI病位在腦,病機為氣滯、瘀血、痰濕阻滯經絡導致清竅阻蔽,或者氣機逆亂。故治療原則采用活血化瘀、化痰開竅、疏通經絡、調理氣機。我們文獻研究結果[3]顯示,針灸治療TBI多選督脈、手足陽明經腧穴。其一,督脈與腦有著密切的關系,《難經》有:“督脈者,起于下極之俞,并于脊里,上至風府,入屬于腦”的記述,并多次與手足三陽經及陽維脈交會。其二,從功能上看,督脈有“總督諸陽”之功,為“陽脈之?!?,調節(jié)全身陽經,且對整個經脈系統有統帥作用。其三,現代研究也認為督脈位居身體的中軸線上,通過雙側神經調節(jié),能起到促進腦功能的代償和重組作用。陽明經脈多氣多血,TBI因氣滯、氣亂、血瘀造成,故多用陽明經上的穴位來活血化瘀、行氣通經。
本研究中,選用的腧穴為百會、人中、內關和足三里。百會為“三陽五會”,穴居巔頂,屬督脈通于腦,具有醒腦安神、升清化濁的作用。針刺督脈百會穴,可以改善大鼠自由基代謝,促進受損神經元修復,提高其學習記憶能力的作用,同時能減輕腦水腫,有助于瘀血的消散吸收,對腦缺血及再灌注損傷具有一定的保護作用。另外,有研究認為百會位于大腦的前動脈主干投影區(qū),也為皮層運動、感覺區(qū)上部的投影區(qū),針刺百會對改善大腦的前動脈血液循環(huán),興奮皮層運動區(qū),感覺區(qū)有重要意義。人中為督脈經與手陽明大腸經及足陽明胃經之交會穴,有清熱開竅,鎮(zhèn)痛寧神,回陽救逆,祛風止痛之功?,F代研究表明,針刺人中能興奮腦神經元、整合復雜的中樞神經系統、促進腦組織血液循環(huán),增加腦灌注量。實驗研究也證實人中對腦損傷后意識障礙及腦電圖的改善優(yōu)于其他穴位。足三里為足陽明胃經穴位,選其以扶正,補后天氣血生化之源以治本,調和經脈,疏通氣血??傊?,諸穴合用,可以達到醒腦開竅、通經活絡、調整氣機之效,促進TBI損傷腦組織的恢復。
Lee的實驗表明[4]NGF與許多中樞和周圍神經系統病變密切相關,在學習、記憶、神經細胞損傷后的恢復中起重要的調節(jié)作用。Dekosky[5]等研究發(fā)現創(chuàng)傷性腦損傷中NGF蛋白在大腦皮質明顯增加,其mRNA于傷后1d增加5倍,認為NGF在神經損害后神經再生和修復中起保護作用。本研究在不同時間開始針刺治療TBI的時效作用的實驗中,結果免疫組化和Western-blot法檢測均發(fā)現模型組對照組動物腦組織皮層NGF表達略有降低,同空白組比較有統計學意義(P<0.05),這可能由于損傷時間較長,在病理情況下升高的NGF沒有得到即時的治療維持、很快的消耗導致,針刺組腦組織中NGF含量均明顯高于空白組、模型組,表明針刺對腦組織中NGF的含量確有上調作用。進一步,我們運用熒光定量PCR觀測其相應mRNA表達的情況,結果發(fā)現針刺對NGFmRNF的表達的調控作用也同樣如此。且針刺1組優(yōu)于針刺2組、針刺3組,針刺2組優(yōu)于針刺3組,且組間比較具有統計學意義(P<0.01)。表明針刺介入治療TBI的時間可能越早越有利于發(fā)揮針刺上調腦組織神經元的神經生長因子NGF及相應mRNA表達,達到保護腦組織神經元的作用。
[1]RABACCHI SA,ENSINI M,BONFANTIL,et al.Nerve growth factor reduces apoptosis of axotomized retinal ganglion cells in the neonatal rat[J].Neurosci,1993,63(4):969-973.
[2]Mobley W C,Rutkowski J L,Tennekoon G I,et al.Choline acetyl-transferase activity in striatum of neonatal rats increased by nerve growth factor[J].Science,1985,229(4710):284.
[3]郭新榮,王瑞輝,李 娜,等.針刺治療顱腦損傷用穴規(guī)律的現代文獻研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2013,24(6):1433-1435.
[4]Lee T H,Kato H,Chen S T,et al.Expression of nerve growth factor and trk A after transient focal cerebral ischemia in rats[J].Stroke,1998,29(9):1687-1697.
[5]Dekosky S T,Goss J R,Miller P D,et al.Upregulation of nerve growth factor following cortical trauma[J].Exp Neurol,1994,130(2):173-177.