熊萬(wàn)成，高春芳，范乃軍

應(yīng)用液體蛋白芯片—飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)研究乳腺癌血清差異蛋白表達(dá)

熊萬(wàn)成1，高春芳2，范乃軍2

目的分析乳腺癌與健康人血清蛋白質(zhì)譜差異，篩選特異性蛋白標(biāo)志物，建立乳腺癌診斷預(yù)測(cè)模型，評(píng)價(jià)其診斷價(jià)值。方法將58例乳腺癌和57例健康女性的血清，隨機(jī)分為建模組和驗(yàn)證組，應(yīng)用弱陽(yáng)離子納米磁珠(MB-WCX)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)建立血清蛋白質(zhì)譜，選擇遺傳算法建立乳腺癌診斷預(yù)測(cè)模型，利用診斷模型對(duì)驗(yàn)證組進(jìn)行盲篩驗(yàn)證。結(jié)果通過(guò)蛋白質(zhì)譜，篩選出29個(gè)顯著差異蛋白質(zhì)峰(P<0.05)。其中乳腺癌中表達(dá)上調(diào)2個(gè)，表達(dá)下調(diào)27個(gè)，利用其中8個(gè)差異峰(質(zhì)荷比分別為698.3、797.37、1 449.56、1 466.65、1 520.74、1 584.55、2 379.26、2 739.69)建立診斷模型，獲得了96.55%(28/29)的敏感性和96.42%(27/28)的特異性，經(jīng)獨(dú)立樣本雙盲驗(yàn)證，得到靈敏度為 93.10%(27/29)，特異度為96.55%(28/29)。結(jié)論應(yīng)用弱陽(yáng)離子納米磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)可篩選出血清蛋白質(zhì)譜中的差異蛋白質(zhì)，據(jù)此建立的診斷模型具有較高的敏感性和特異性，對(duì)于乳腺癌的輔助診斷有一定的臨床意義。

乳腺癌；基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行質(zhì)譜；蛋白質(zhì)組學(xué)；磁珠；診斷模型

目前乳腺癌為女性疾病中發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率正以每年3%的速度遞增，給世界范圍內(nèi)患乳腺癌的女性患者帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和思想負(fù)擔(dān)。若能對(duì)其早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷，在治療上可以取得良好效果，預(yù)后也可以得到明顯的改善。而目前用于乳腺癌的篩查及診斷方法在臨床上應(yīng)用效果并不理想[1-2]。隨著腫瘤診斷技術(shù)水平的不斷提高，乳腺癌的篩檢和早期診斷正在從傳統(tǒng)的檢測(cè)方法向基因診斷和分子生物學(xué)方向發(fā)展[3-4]。從血清中尋找確切可用于乳腺癌診斷的特異性生物標(biāo)志物是蛋白組學(xué)研究的主要方向之一，液體芯片—飛行質(zhì)譜技術(shù)為乳腺癌標(biāo)志物的篩選提供了理想的技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象乳腺癌組選自解放軍第150中心醫(yī)院2010年10月～2012年5月住院患者，經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診；乳腺癌組58例，均為女性，年齡29～78歲，中位年齡53歲；采血前未行放、化療及手術(shù)等干預(yù)治療；根據(jù)2003年第6版AJCC乳腺癌TNM臨床分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期20例，Ⅲ期病人23例。正常對(duì)照組57例，均為女性，年齡44～76歲，中位年齡58歲；選自本院同期體檢中心健康查體者，檢查結(jié)果證實(shí)無(wú)乳腺疾病。所有研究對(duì)象采血前均簽署了知情同意書(shū)，經(jīng)解放軍第150中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。以上所選患者均經(jīng)臨床檢查排除重要臟器(心、肺、肝和腎等)疾病和明確無(wú)內(nèi)分泌疾病。采集志愿者清晨空腹靜脈全血3 mL(不加抗凝劑 )，室溫靜置20 min后，以 2 000 r/min離心15 min，將淡黃色上層血清取出并分裝EP管，凍存于-80℃冰箱。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，樣品常溫解凍，待用。乳腺癌患者于術(shù)前當(dāng)日清晨采集，處理方法同上。按照完全隨機(jī)化的方法，將乳腺癌患者與健康志愿者分為建模組與驗(yàn)證組，其中，建模組包括乳腺癌29例與健康志愿者28例，驗(yàn)證組乳腺癌患者與健康志愿者均為29例。

1.2 試劑與儀器基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS) MALDI-TOF-MS Autoflex-Ⅲ、弱陽(yáng)離子納米磁珠(MB-WCX)試劑盒、α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4- hydroxycinnamic acid， HCCA) 和混合標(biāo)肽均購(gòu)自德國(guó)Bruker Daltonics公司，乙腈(ACN)、 三氟乙酸(TFA)、SPA(Sinapinic acid)、 尿素、DTT、CHAPS、Tris-HCl、NaAC等購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司。

1.3 方法

1.3.1 WCX磁珠純化分選多肽 磁珠試劑盒存放: 4℃冰箱冷藏。磁珠結(jié)合血清中的蛋白/多肽操作流程: ①取出磁珠懸浮液上下顛倒搖動(dòng)1 min，使之完全混和均勻，備用；②向樣品管中加入10 μL磁珠結(jié)合緩沖液(BS)；③再加入10 μL磁珠混懸液混和均勻；④取凍融的待測(cè)血清5 μL吸打混勻5 次以上；⑤室溫靜置5 min；⑥樣品管放進(jìn)磁珠分離器，使磁珠貼壁1 min直到液體清亮；⑦吸取上清；⑧加入磁珠清洗緩沖液(WS)100 μL，在磁珠分離器前后兩孔間反復(fù)移動(dòng)樣品管10 次；⑨樣品管靜置于磁珠分離器中，使磁珠貼壁1 min直到液體清亮，吸取上清，在吸取的過(guò)程中避免攪渾懸浮液而吸走磁珠；⑩重復(fù)⑧⑨步驟2次，最后一次加樣槍吸去全部懸浮液。洗脫磁珠結(jié)合蛋白: ①向結(jié)合了蛋白的磁珠樣品中加入5 μL 磁珠洗脫緩沖液(ES)，反復(fù)吸打混勻磁珠；②樣品管靜置于磁珠分離器中2 min，使磁珠貼壁，與液體完全分離，取上清液移入0.5 mL 樣品管；③向0.5 mL樣品管中加入穩(wěn)定緩沖液(SS)5 μL吸打混勻；④加入穩(wěn)定緩沖液的洗脫液可以用來(lái)直接質(zhì)譜分析或-20℃凍存24 h內(nèi)質(zhì)譜分析。

1.3.2 質(zhì)譜檢測(cè)與數(shù)據(jù)采集 采用Autoflex-Ⅲ MALDI-TOF-MS儀器，應(yīng)用線性模式，設(shè)定儀器參數(shù)：離子源1電壓：20.0 kV，離子源2電壓：18.6 kV，棱鏡電壓：6.6 kV，脈沖離子間隔：120 ns，離子化需晶體激光頻率：200 Hz，基質(zhì)信號(hào)抑制質(zhì)核比：600 Da，采集范圍：相對(duì)分子量范圍600～18 000。應(yīng)用Flexcontrol 3.3軟件采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，F(xiàn)lexanalysis3.3軟件對(duì)所采集質(zhì)譜圖進(jìn)行優(yōu)化處理，包括質(zhì)譜圖的平滑、衰減及標(biāo)峰處理，并輸出含有質(zhì)荷比值和峰強(qiáng)度的Excel格式數(shù)據(jù)；ClinproTools2.2對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析建模組樣本質(zhì)譜圖，選擇遺傳算法(GA)建立診斷模板，計(jì)算靈敏度與特異度。

2 結(jié)果

2.1 差異蛋白質(zhì)定量分析建立建模組樣本(乳腺癌37例，正常人35例)血清蛋白質(zhì)譜，在分子質(zhì)量600～18 000范圍內(nèi)共檢測(cè)到79個(gè)蛋白峰。比較分析乳腺癌與健康志愿者之間差異蛋白質(zhì)譜，共發(fā)現(xiàn)29個(gè)蛋白峰有顯著性差異(P<0.05)。其中在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)峰2個(gè)，表達(dá)下調(diào)峰27個(gè)，見(jiàn)表1。

2.2 診斷模板的建立利用ClinproTools2.2中遺傳算法(GA)建立了由8個(gè)差異表達(dá)蛋白(質(zhì)荷比分別為698.3、797.37、1 449.56、1 466.65、1 520.74、1 584.55、2 379.26、2 739.69)組成的診斷模型，能有效地將乳腺癌和正常人區(qū)分開(kāi)，獲得了96.55%(28/29)的敏感性和96.42%(27/28)的特異性。分子量為1 449.56、1 520.74、1 584.55及2 739.69 的4個(gè)蛋白診斷乳腺癌的ROC曲線下面積分別為0.91、0.81、0.87及0.79。見(jiàn)圖1。

表1 在乳腺癌中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白

A：質(zhì)荷比1 449.56；B：質(zhì)荷比1 520.74；C：質(zhì)荷比：1 584.55；D：質(zhì)荷比2 739.69

2.3 診斷模板的評(píng)價(jià)為進(jìn)一步評(píng)價(jià)本研究中所建立診斷模板的診斷價(jià)值，利用診斷模板對(duì)驗(yàn)證組樣本進(jìn)行雙盲驗(yàn)證，結(jié)果顯示其靈敏度為93.10%(27/29)，特異度為96.55%(28/29)，約登指數(shù)為0.89。對(duì)軟件自動(dòng)篩選出最具鑒別分類(lèi)能力的兩個(gè)蛋白(質(zhì)荷比為1 450和2 740)進(jìn)行分析，以蛋白1 450為X軸，2 740為Y軸建立坐標(biāo)系的樣品分布圖(坐標(biāo)值代表相應(yīng)蛋白豐度)，可見(jiàn)兩組樣品交差區(qū)域較少，說(shuō)明兩個(gè)蛋白的分組能力良好，見(jiàn)圖2。

圖2 質(zhì)荷比為2 740和1 450兩個(gè)蛋白對(duì)乳腺癌和健康對(duì)照組蛋白豐度分布圖

3 討論

乳腺癌的發(fā)病率占全身惡性腫瘤的7%～10%，嚴(yán)重危害了女性的身心健康。若能對(duì)其早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療，在治療上可以取得良好效果。但目前的檢查手段靈敏度、特異度及受檢對(duì)象的順應(yīng)性均不高[5]。目前臨床常用的腫瘤標(biāo)記物，如CAl5-3、CAl25、CAl99和CEA等，在乳腺癌的早期診斷中應(yīng)用價(jià)值并不高[6]。將CAl5-3、CAl25和CEA等幾個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)，在一定程度上可以提高早期乳腺癌的診斷率，但敏感度也只有53.8%[7]，依然不能滿足臨床早期診斷乳腺癌的需要。

液體芯片—飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)最新研發(fā)并用于臨床研究的技術(shù)成果,具有準(zhǔn)確度高、分析快速、高通量、靈敏度高、重復(fù)性好和分辨率高等特點(diǎn)[8-11]，該技術(shù)已經(jīng)在多個(gè)系統(tǒng)的腫瘤中獲得了豐碩的研究成果：其中α-纖維蛋白原(FPA)、補(bǔ)體C3f、激肽原等均在多種腫瘤，如頭頸部鱗癌(HNSCC)、口腔癌[12]、結(jié)直腸癌[13]、胃癌[14]、膀胱癌、前列腺癌[15]、乳腺癌[16]等中呈現(xiàn)差異表達(dá)，表明其有成為新的腫瘤標(biāo)志物的潛能。另外，該技術(shù)在檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、急性淋巴細(xì)胞白血病、哮喘[8，17-18]、肺炎[19]病人中也有很好的應(yīng)用。

本研究采用聯(lián)合應(yīng)用弱陽(yáng)離子交換磁珠(MB-WCX)和MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)乳腺癌和正常人血清蛋白質(zhì)譜，通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)了79個(gè)差異蛋白，其中有29個(gè)差異蛋白具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用ClinproTools2.2中遺傳算法(GA)建立了由8個(gè)差異表達(dá)蛋白(Mr分別為698.3、797.37、1 449.56、1 466.65、1 520.74、1 584.55、2 379.26、2 739.69Dr)組成的診斷模型，能有效地將乳腺癌和正常人區(qū)分開(kāi)，獲得了96.55%(28/29)敏感性和96.42%(27/28)的特異性。利用診斷模板對(duì)驗(yàn)證組樣本進(jìn)行雙盲驗(yàn)證，結(jié)果顯示其靈敏度為93.10%(27/29)，特異度為96.55%(28/29)，約登指數(shù)為0.89。上述結(jié)果明顯優(yōu)于目前臨床常用的腫瘤標(biāo)志物，如CAl5-3、CAl25、CAl99和CEA等及其聯(lián)合檢測(cè)效能。值得關(guān)注的是，在比較乳腺癌患者與健康女性的血清蛋白質(zhì)時(shí)，質(zhì)荷比(M/Z)為1 449.56、1 584.55的兩個(gè)蛋白差異顯著(P<0.0001)，有望成為診斷乳腺癌新的腫瘤標(biāo)志物。

本研究中發(fā)現(xiàn)了1組對(duì)乳腺癌早期診斷有價(jià)值的蛋白質(zhì)/多肽，對(duì)其進(jìn)行鑒定和功能分析將有助于闡明乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，但由于技術(shù)上的局限性或者現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)的不完整，對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定工作未取得滿意結(jié)果。因此，今后的研究方向就是不斷地采用新技術(shù)、新方法對(duì)差異蛋白進(jìn)行鑒定和功能描述。

綜上所述，乳腺癌患者與正常對(duì)照血清之間存在著具有顯著性差異的蛋白質(zhì)，聯(lián)合應(yīng)用弱陽(yáng)離子交換磁珠和MALDI質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合遺傳算法(GA)等生物信息學(xué)、生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法有望篩選出乳腺癌診斷標(biāo)志蛋白。本課題的研究成果為乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展研究提供了新的線索，為乳腺癌的輔助診斷提供了新的思路。

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ProteomicProfilingofBreastCancerinSerumUsingMagneticBeadBasedSamplefractionationandMALDI-TOF-MS

XIONG Wan-cheng,GAO Chun-Fang,FAN Nai-Jun

(Xinxiang Medical University,Xinxiang 453000,China)

ObjectiveTo analyze the differentially expressed proteins in the serum of breast cancer patients and control group so as to filter out protein markers of breast cancer ,and to build a predictive model of breast cancer.MethodsSerum samples were collected from 58 patients with breast cancer and 56 healthy controls,and randomized into model construction group and validation group.WCX Magnetic bead and matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technology were used to detect serum samples from patients with breast cancer and healthy individuals.Flex Analysis software was used to deal with mass spectrometry data.The model was built using ClinproTools2.2 software and was further evaluated in a blind test for reliability.ResultsTwenty-nine differentially expressed proteins in serum were screened by comparing serum protemic spectra between breast cancer patients and healthy individuals,including 2 up-regulated proteins and 27 down regulated ones.Eight proteins (M/Z 698.3，797.37，1 449.56，1 466.65，1 520.74，1 584.55，2 379.26，2 739.69) were obtained for developing a ClinProt model which was able to classify breast cancer patients and healthy individuals with a sensitivity of 96.55%(28/29)and a specificity of 96.42%(27/28).In a double blind validation,the ClinProt model yielded a sensitivity of 93.10%(27/29) and a specificity of 96.55%(28/29).ConclusionCombination of MALDI-TOF-MS and WCX magnetic bead technology can directly screen the differential expressed protein from healthy controls and breast cancer,and these proteins are suitable for diagnosis of early-stage breast cancer.They have clinical significance for enhancement of sensitivity and specificity of breast cancer diagnosis.

breast cancer；MALDI-TOF-MS；proteomics；magnetic bead；diagnostic pattern

2014-03-27

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003 2.中國(guó)人民解放軍第150中心醫(yī)院全軍肛腸外科研究所，河南洛陽(yáng) 471000

熊萬(wàn)成(1984-)，男，河南駐馬店人，在讀碩士研究生，從事腫瘤的蛋白組學(xué)研究工作。

R730.43,R737.9

A

1672-688X(2014)02-0089-05