楊 暉，和素娜，杜景霞，李 艷，路西明，王建剛，呂茂平

Folin-Ciocalteu法測定山茱萸果核水溶性提取物多酚含量的研究

楊 暉1，和素娜1，杜景霞1，李 艷1，路西明1，王建剛1，呂茂平2

目的以沒食子酸為標準物質(zhì)，研究Folin-Ciocalteu法測定山茱萸果核水溶性提取物多酚含量的優(yōu)化條件。方法以吸光度為評價指標，分別研究了檢測波長、Folin-Ciocalteu試劑用量、Na2CO3用量、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間對測定結(jié)果的影響。結(jié)果優(yōu)化測定條件：檢測波長760 nm，0.4 mL樣品加入Folin-Ciocalteu試劑1.0 mL、10%Na2CO3溶液3.2 mL，反應(yīng)溫度35 ℃，顯色反應(yīng)時間1.0 h，吸光度與多酚含量在0～250 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(y=0.0053x+0.0389，R2=0.9993)。方法的加標回收率為98.5%～103.0%，相對標準偏差為1.9%～2.3% (n=6)。三批山茱萸果核水溶性提取物多酚含量平均值為39.24%。結(jié)論Folin-Ciocalteu法在本研究建立的優(yōu)化測定條件下顯色靈敏、準確可靠、穩(wěn)定性高、簡便易行，適用于山茱萸果核水溶性提取物多酚的含量測定。

Folin-Ciocalteu法；山茱萸果核；水溶性提取物；多酚

山茱萸(CornusoficinalisSeib．etZucc)作為傳統(tǒng)中藥材，市場需求量很大，但因通常只使用干燥成熟果肉入藥，導(dǎo)致含有大量營養(yǎng)物質(zhì)的果核被丟棄，造成資源浪費[1-2]。多酚是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、抗氧化以及抗菌等多種生理功能[3-5]。已有的山茱萸果核化學(xué)成分的研究表明其含有較多的多酚類物質(zhì)[6]，但有關(guān)山茱萸果核水溶性提取物多酚含量的測定研究還未見報道。Folin-Ciocalteu法是常用的植物多酚測定方法，具有操作簡便、準確度和精密度高等優(yōu)點，但不同樣品的測定條件有較大差別[7-8]。本文研究了Folin-Ciocalteu法測定山茱萸果核水溶性提取物多酚含量的優(yōu)化條件，以期為其藥用價值研究與綜合利用提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑可見分光光度計722s(上海棱光)；三用恒溫水箱HH-600J(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52CS-1(上海亞榮生化儀器廠)；冷凍干燥機FD-1D-50(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；分析天平FA2204B(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)；山茱萸果核采集于河南省洛陽市嵩縣，經(jīng)河南科技大學(xué)路西明教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果核；沒食子酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-201204)；Folin-Ciocalteu試劑(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；其余試劑均為分析純，實驗用水為去離子蒸餾水。

1.2 樣品制備取800 g粉碎后的山茱萸果核置于滲漉柱中，加石油醚脫脂，直至滲漉液和石油醚顏色相同時停止。將脫脂后的果核晾干后重新置于滲漉柱中，加丙酮滲漉，直至用FeCl3溶液檢測滲漉液結(jié)果為陰性時停止。將滲漉液置于50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸干后所得黏稠物質(zhì)，冷卻后用水分散。將分散液置于分液漏斗中，依次用乙酸乙酯和正丁醇進行萃取(水層與有機溶劑的體積比為1.5∶1)，最后將所得水層經(jīng)70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和-49℃冷凍干燥處理后得到水溶性提取物。

1.3 方法

1.3.1 沒食子酸標準溶液的配制 精確稱取沒食子酸100 mg，用水溶解并定容至100 mL，然后精確移取5.00 mL 于50 mL容量瓶中并定容，即得到質(zhì)量濃度100 μg/mL的沒食子酸標準溶液。

1.3.2 供試品溶液的配制 精確稱取山茱萸果核水溶性提取物50 mg，用水溶解并定容至50 mL，然后精確移取5.00 mL于25 mL容量瓶中并定容。

1.3.3 測定條件的優(yōu)化 ①檢測波長：用移液管分別移取100 μg/mL沒食子酸標準溶液和供試品溶液各0.4 mL于10 mL棕色容量瓶中，加入1.0 mL水、1.0mL Folin-Ciocalteu試劑，混勻靜止3 min后加入3.0 mL 10% Na2CO3溶液，用水定容，常溫下反應(yīng)1.5 h后，用紫外—可見分光光度計在400～800 nm范圍內(nèi)掃描，從而選擇最佳測定波長。②Folin-Ciocalteu試劑用量：取6份0.4 mL的100 μg/mL沒食子酸標準溶液于10 mL棕色容量瓶中，分別依次加入1 mL水和不同體積(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL)的Folin-Ciocalteu試劑，混勻靜止3 min后加入3.2 mL 10% Na2CO3溶液，用水定容，室溫下反應(yīng)1.5 h后，在最佳測定波長處測量吸光度，以確定Folin-Ciocalteu試劑的最佳用量。③Na2CO3用量：取6份0.4 mL的100 μg/mL沒食子酸標準溶液于10 mL棕色容量瓶中，加入1.0 mL水和最佳用量的Folin-Ciocalteu試劑，混勻靜止3 min后分別加入不同體積(0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8 mL)的10% Na2CO3溶液，用水定容，常溫下反應(yīng)1.5 h后，在最佳測定波長處測量吸光度，以確定碳酸鈉溶液的最佳用量。④顯色溫度：取6份0.4 mL的100 μg/mL沒食子酸標準溶液于10 mL棕色容量瓶中，加入1.0 mL水和最佳用量的Folin-Ciocalteu試劑，混勻靜止3 min后加入最佳用量的10%Na2CO3溶液，用水定容，分別在溫度25、30、35、40、45、50 ℃時反應(yīng)1.5 h，在最佳測定波長處測量吸光度，以確定顯色反應(yīng)的最適溫度。⑤顯色時間：取6份0.4 mL的100 μg/mL沒食子酸標準溶液于10 mL棕色容量瓶中，依次加入1.0 mL水和最佳用量的Folin-Ciocalteu試劑，混勻后等待3 min，再加入最佳用量的10% Na2CO3溶液，用水定容，在最適溫度下分別反應(yīng)0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后，在最佳測定波長處測量吸光度，以確定顯色反應(yīng)完全所需的時間。

1.3.4 標準曲線的建立 分別配制0、10、25、50、100、200、250 μg/mL沒食子酸標準溶液，按1.3.3節(jié)優(yōu)化的測定條件，測定吸光度。以標準溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.5 樣品含量的測定 精確移取供試品溶液各0.4 mL于10 mL棕色容量瓶中，按1.3.3中優(yōu)化的測定條件，測定吸光度，然后根據(jù)標準曲線計算出樣品中多酚的含量。

2 結(jié)果

2.1 測定條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長 經(jīng)測試，沒食子酸和供試品溶液均在760 nm出現(xiàn)最大吸收峰，因此760 nm即為最佳檢測波長。

2.1.2 Folin-Ciocalteu試劑用量 Folin-Ciocalteu試劑的用量對顯色反應(yīng)的程度有影響，試驗表明，吸光度隨著Folin-Ciocalteu試劑用量的增加而增大，但在用量超過1.0 mL后，吸光度不再有明顯變化，因此Folin-Ciocalteu試劑的最佳用量為1.0 mL。

2.1.3 Na2CO3用量 顯色溶液的堿性強弱對多酚類化合物的顯色效果具有一定的影響，試驗表明，Na2CO30.8～2.4 mL，隨著Na2CO3溶液用量的增加，吸光度明顯增大，但加入量達到2.4 mL以后，吸光度的增長趨緩，在3.2 mL時達到最大值，因此10%Na2CO3的最佳用量為3.2 mL。

2.1.4 顯色溫度 溫度影響多酚物質(zhì)的穩(wěn)定性，試驗表明，25～35℃時，吸光度隨著溫度的升高逐步增大，在35～45℃時吸光度值趨于穩(wěn)定，溫度高于45℃時，隨著溫度的增加吸光度逐漸變小，因此顯色反應(yīng)最適溫度為35℃。

2.1.5 顯色時間 試驗表明，當顯示時間在1.5 h以內(nèi)時，吸光度隨著反應(yīng)時間的延長而逐漸增大，在1.0 h時吸光度達到最大，1.0 h后標準溶液的吸光度稍有下降，但基本趨于穩(wěn)定，因此最適反應(yīng)時間確定為1.0 h。

2.2 標準曲線的建立試驗結(jié)果表明，在優(yōu)化的測定條件下，沒食子酸標準溶液的吸光度與質(zhì)量濃度在0～250 μg/mL范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系，標準曲線方程為：y=0.0053x+0.0389，R2=0.9993。

2.3 分析方法的評價

2.3.1 重復(fù)性 取0.4 mL供試品溶液于10 mL棕色容量瓶中，按優(yōu)化的測定條件連續(xù)測定6次吸光度，分別為0.475、0.474、0.473、0.473、0.474和0.473，相對標準偏差為0.17%。

2.3.2 穩(wěn)定性實驗 取0.4 mL供試品溶液于10 mL棕色容量瓶中，按優(yōu)化的測定條件反應(yīng)1.0 h后，于2.5 h內(nèi)每隔30 min，在760 nm處測定一次吸光度，分別為0.476、0.473、0.469、0.467、0.466和0.462，相對標準偏差為1.2%。

2.3.3 精密度實驗 分別取6份0.4 mL供試品溶液于10 mL棕色容量瓶中，按優(yōu)化的測定條件測定吸光度，根據(jù)2.2中所得的標準曲線計算，得到供試品溶液中多酚含量分別為80.6、81.4、80.3、83.9、81.7和82.5 μg/mL，平均值為81.7 μg/mL，相對標準偏差為1.6%。

2.3.4 加標回收實驗 向已知含量的供試品溶液中，分別加入一定濃度的沒食子酸標準溶液，按優(yōu)化的測定條件測定吸光度，根據(jù)2.2中所得的標準曲線計算沒食子酸的回收率和實驗結(jié)果的相對標準偏差，結(jié)果見表1。

表1 加標回收實驗結(jié)果

2.4 樣品含量的測定在優(yōu)化條件下進行了3批山茱萸果核多酚水溶性提取物供試品溶液的吸光度測定，并將結(jié)果代入2.2中所得的標準曲線計算供試品溶液中多酚的含量，然后經(jīng)換算得到樣品中多酚含量的結(jié)果分別為：39.45%、38.43%和39.83%，平均值為39.24%，相對標準偏差為1.8%。

3 討論

實驗結(jié)果表明，以沒食子酸為標準物質(zhì)，用Folin-Ciocalteu法測定山茱萸果核水溶性提取物中的多酚含量的優(yōu)化條件為：供試品溶液0.4 mL、Folin-Ciocalteu試劑1.0 mL、10%Na2CO3溶液3.2 mL、反應(yīng)時間1.0 h、反應(yīng)溫度35 ℃，測定波長760 nm，吸光度與多酚含量在0～250 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，精密度高，加標回收率為98.5%～103.0%，相對標準偏差為1.9%～2.3% (n=6)，可用于實際樣品的測定，結(jié)果令人滿意，可為山茱萸果核水溶性提取物的相關(guān)藥用研究與利用提供依據(jù)。

[1]國家藥典委員會.中國藥典(一部)[s].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:278.

[2]朱丹,徐少軍,杜梨果,等.山茱萸及其果核的研究現(xiàn)狀[J].河南科技大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2011,29 (4): 312-315.

[3]李曉明,姜華,李軍,等.山茱萸果核中多酚的抗氧化活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(4): 902-903.

[4]蘇曉雨.紅松種殼組成及多酚提取分離與抗氧化抗腫瘤功能研究[D].哈爾濱工業(yè)大學(xué),2010.

[5]喻謹,岳永德,湯鋒,等.Folin-Ciocalteu法測定竹葉中總多酚含量[J].光譜實驗室,2013,30(6): 2752-2758．

[6]劉瑞林,詹漢英,陳鈿,等.山茱萸籽油的響應(yīng)曲面優(yōu)化微波輔助提取及成分分析[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2012,40(6): 47-51.

[7]Berker K I,Olgun A O,Ozyurt D,et al.Modified Folin-Ciocalteu antioxidant capacity assay for measuring lipophilic antioxidants[J].J Agric Food Chem,2013,61(20): 4783-4791．

[8]徐佳,辛立方,張瑞廷,等.改良的Folin-Ciocalteu比色法測定核桃外果皮中總多酚含量[J].食品工業(yè)科技,2012,33(6):60-63．

StudyonDeterminationofPolyphenolsinWater-solubleExtractofCornusOfficinalisKernelsbyFolin-CiocalteuMethod

YANG Hui,HE Su-na,DU Jing-xia,et al

(Medical College,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveThe optimum conditions of Folin-Ciocalteu method for the determination of polyphenols content in the water-soluble extract of cornus officinalis kernels was studied by using gallic acid as the standard substance.MethodsAbsorbency was adopted as evaluation index,factors that influenced the detection performance,such as the detection wavelength,the amount of Folin-Ciocalteu reagent,the amount of sodium carbonate,reaction time and reaction temperature were investigated.ResultsThe optimum conditions for polyphenols determination by Folin-Ciocalteu method were as follows: 1.0 mL of Folin-Ciocalteu reagent was added in 1.0 mL of sample,and then 3.2 mL of 10% sodium carbonate solution was added.After the coloration reaction was for 1.0 h at 35℃,the absorbance was measured at 760 nm.Under the optimum conditions,the absorbance increased linearly with the concentration of gallic acid in the range of 0 to 250 μg/mL (y=0.0053x+0.0389,R2=0.9993).The average spiked recoveries were 98.5%～103.0% with the relative standard deviations of 1.9%～2.3% (n=6).The average value of polyphenols content in the water-soluble extract of cornus officinalis kernels from three batches was 39.24%.ConclusionFolin-Ciocalteu method established in this study is simple,fast,highly sensitive and very stable.It is suitable to be applied to determine polyphenols content in the water-soluble extract of cornus officinalis kernels.

Folin-Ciocalteu method；cornus officinalis kernel；water-soluble extract；polyphenol

河南省重點科技攻關(guān)項目(No.082102310031)

河南科技大學(xué)校青年基金資助項目(2012QN014)

2014-04-08

1.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽 471003 2.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利審查協(xié)作中心，北京 100083

楊暉(1982-)，女，河南洛陽人，博士，講師，從事藥物分析教學(xué)與研究工作。

R284.1

A

1672-688X(2014)02-0084-03