孫吏聰，李 松，張玉昆

IGF-1誘導(dǎo)外胚間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化的實驗研究

孫吏聰1，李 松2，張玉昆3

目的探討胰島素樣生長因子-1(IGF-1)誘導(dǎo)胎鼠頜突外胚間充質(zhì)細胞向成骨細胞(OB)分化的作用。方法采用消化貼壁法培養(yǎng)SD 胎鼠外胚間充質(zhì)細胞，建立外胚間充質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)細胞模型。在含有20 ng/mL IGF-1培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)10 d。HE染色，觀察細胞形態(tài)變化；抗Ι型膠原單抗免疫組化染色鑒定細胞性質(zhì)；堿性磷酸酶活性檢測。結(jié)果經(jīng)IGF-1培養(yǎng)的外胚間充質(zhì)細胞，10 d 后在倒置顯微鏡下可見細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化；細胞爬片HE染色，可見細胞呈不規(guī)則形態(tài)，邊緣伸出多個突起；抗Ι型膠原單抗免疫組化染色陽性；堿性磷酸酶活性增高。結(jié)論外胚間充質(zhì)細胞經(jīng)IGF-1的誘導(dǎo)培養(yǎng)，細胞形態(tài)出現(xiàn)類成骨樣改變，同時細胞分泌堿性磷酸酶和Ι型膠原，出現(xiàn)類似成骨細胞的功能性改變。

外胚間充質(zhì)細胞；成骨細胞；IGF-1；細胞分化；免疫組化

外胚間充質(zhì)細胞是在胚胎發(fā)育過程中由顱神經(jīng)嵴向腹外側(cè)遷移到達頜突中胚層后形成的，是一種具有多向分化潛能的干細胞[1]，可進一步分化為成牙本質(zhì)細胞和成骨細胞，并最終參與形成上、下頜骨等[2]。上頜骨骨縫中間充質(zhì)細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化可以促進上頜骨的發(fā)育。間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化受到多種因素的影響，其中與骨縫中細胞因子水平有密切關(guān)系。本實驗采用胰酶消化法分離間充質(zhì)細胞，經(jīng)反復(fù)貼壁法取得純化外胚間充質(zhì)細胞，進而建立SD 胎鼠頜突外胚間充質(zhì)細胞模型；經(jīng)過胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可以向成骨細胞分化。探討外胚間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化的機制，有助于顱頜面生長發(fā)育的研究，對顱頜面畸形的防治均有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 組織來源和試劑妊娠10～11 d SD 大鼠(昆明醫(yī)學院重點實驗室)，DMEM/F12 (D/F12)培養(yǎng)基(Gibco，美國)，胎牛血清(FBS)， Hank’s 液(Solarbio科技，北京)，2.5 g/L胰酶(Gibco，美國)，抗波形絲蛋白單克隆抗體(Vimentin，美國)，SABC 免疫組化試劑盒(DAKO，美國)，DAB顯色劑(武漢博士德)， IGF-1(Peprotech，英國)，抗Ι型膠原單抗(Santa Cruz，美國)，堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(北京中生公司)。

1.2 主要儀器相差倒置顯微鏡 (OLYMPUS IMT-2 USA)，CO2恒溫培養(yǎng)箱 (上海市實驗儀器總廠)，超凈工作臺(蘇州凈化TDGC2J-1型)，圖像采集系統(tǒng)(德國Leica DM LS2型顯微鏡及Leica DFC320型CCD)。酶標板自動讀數(shù)儀(Bioteck BL340，美國)。

1.3 SD胎鼠頜突外胚間充質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)、免疫組化鑒定無菌條件下剖腹取出10～11 d 的SD胎鼠，采用消化貼壁法培養(yǎng)SD 胎鼠外胚間充質(zhì)細胞。利用上皮細胞和間充質(zhì)細胞對胰酶的耐受性不同，根據(jù)貼壁時間的差異純化間充質(zhì)細胞(圖1)。做HE染色，光鏡觀察細胞形態(tài)(圖2、3)。用SABC法進行抗波形絲蛋白(VIM)免疫組化染色，胞漿呈陽性著色，鑒定為外胚間充質(zhì)細胞(圖4)。

圖1 第3代間充質(zhì)細胞生長情況(×100)

圖2 間充質(zhì)細胞生長情況(HE，×100)

圖3 間充質(zhì)細胞生長情況(HE，×100)

圖4 細胞抗波形絲蛋白(VIM)染色 (IHC，×100)

1.4 倒置相差顯微鏡觀察取第3代生長狀態(tài)良好的外胚間充質(zhì)細胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)液中加入20 ng/mL的IGF-1，連續(xù)培養(yǎng)10 d，用倒置相差顯微鏡觀察細胞的生長和形態(tài)變化。

1.5 抗Ⅰ型膠原單抗免疫組化染色將IGF-1連續(xù)培養(yǎng)10 d的細胞制作，做HE染色，高倍鏡下觀察細胞爬片形態(tài)改變；將細胞爬片用SABC 法進行抗Ι型膠原單抗免疫組化染色。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學的變化外胚間充質(zhì)細胞經(jīng)IGF-1誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d后，可見細胞呈梭片形、三角形、多邊形。多邊形細胞有多個矢狀突起，呈立方狀，排列緊密(圖5)。細胞爬片HE染色，可見細胞排列緊密，似成骨細胞(圖6、7)。

2.2 抗Ι型膠原單抗免疫組化染色間充質(zhì)細胞經(jīng)IGF-1誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d后，抗Ι型膠原單抗免疫組化染色可見實驗組細胞呈陽性著色，細胞胞漿及細胞核周圍著色(圖8)。而對照組未見此類改變。

圖6 IGF-1培養(yǎng)10 d細胞生長情況(HE，×100)

圖7 IGF-1培養(yǎng)10 d細胞生長情況(HE，×400)

圖8 IGF-1誘導(dǎo)10 d Ι型膠原免疫組化染色 (×400)

2.3 堿性磷酸酶活性結(jié)果加入IGF-1作用后，各實驗組堿性磷酸酶(ALP)活性增高，與對照組相比有顯著差異。經(jīng)方差分析，培養(yǎng)10 d的堿性磷酸酶活性增高，與對照組相比有顯著差異(P<0.01) 。見表1、2。

表1 堿性磷酸酶活性比較(A值)

A：410 nm 堿性磷酸酶光度值。

表2 堿性磷酸酶活性比較

與對照組相比，P<0.01。A：410 nm 堿性磷酸酶光度值。

3 討論

SD胎鼠頜突外胚間充質(zhì)細胞來源于顱神經(jīng)嵴，是一種具有多向分化潛能的胚胎干細胞，可以分化為成牙本質(zhì)細胞和成骨細胞。參與形成頜骨、牙齒等口腔頜面部重要的組織器官[3]。在發(fā)育成熟的上頜骨骨縫中含有豐富的間充質(zhì)細胞，Yano等[4]的研究結(jié)果表明胚胎期的間充質(zhì)細胞和發(fā)育成熟的骨縫間充質(zhì)細胞在形態(tài)學和生物學特性方面沒有明顯差異。Chai等[5]在研究SD胎鼠胚胎發(fā)育的過程中發(fā)現(xiàn)，顱神經(jīng)嵴可以向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化。Basch等[6]認為在胚胎第10.5天(E10.5)時，第1對鰓弓已經(jīng)分化為上頜突和下頜突，神經(jīng)嵴源性外胚間充質(zhì)細胞幾乎全部到達口腔上皮下。此時SD胎鼠頜突表面被覆一層上皮細胞，皮下是豐富的間充質(zhì)細胞。因此，通過妊娠第10～11天的SD胎鼠取得外胚間充質(zhì)細胞，該細胞核大，呈星形、卵圓形且位于中央，生長狀況符合纖維樣細胞。抗波形絲蛋白(VIM) 染色為陽性，說明細胞來源于外胚間充質(zhì)。

IGF-1是一個有70個氨基酸的單鏈堿性蛋白，相對分子質(zhì)量為7.5 kD。人類IGF-1基因位于12號染色體，是體內(nèi)重要的細胞因子之一，在人類體內(nèi)可以由許多組織合成、分泌，主要由成骨細胞產(chǎn)生,它是骨基質(zhì)中含量最多的細胞因子之一[7]。IGF-1生理作用廣泛，幾乎參與體內(nèi)每個器官的生長和功能，尤其具有調(diào)節(jié)成骨細胞和代謝的重要作用。本實驗中外胚間充質(zhì)細胞用20 ng/mL的IGF-1誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后，可見細胞體積迅速增大，由成纖維樣變?yōu)槎嘟切危藞A而居中，1～2個核仁，細胞體突起增多，細胞內(nèi)外可見分泌顆?；蚰遗?，說明細胞分泌能力旺盛。繼續(xù)培養(yǎng)10 d，可見細胞呈多邊形，趨于立方狀，排列緊密，出現(xiàn)類成骨樣改變，表明頜突外胚間充質(zhì)細胞已經(jīng)向成骨細胞分化。

分泌Ι型膠原是成骨細胞最具特征的生物學特性之一，與細胞的進一步分化有很大的關(guān)系[8]。它可以促進間充質(zhì)細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化，成骨細胞所合成分泌的Ι型膠原，可以極大地增加細胞的多層，形成其表面的鈣鹽結(jié)晶沉積，又是有機基質(zhì)演變?yōu)楣墙M織的一個重要步驟。因此Ι型膠原也是體外培養(yǎng)成骨細胞的一個特征性標志物[9]。本實驗中，間充質(zhì)細胞經(jīng)IGF-1誘導(dǎo)10 d后，抗Ι型膠原染色陽性。說明在IGF-1作用下外胚間充質(zhì)細胞可向成骨細胞分化，進而促進頜骨發(fā)育，表明其在頜面部骨發(fā)育過程中起到重要的作用。

堿性磷酸酶(ALP)是在堿性條件下水解多種磷酸酯并具有轉(zhuǎn)磷酸基作用的一組酶，也是成骨細胞的一種細胞外酶，是成骨細胞礦化過程中主要的功能活性酶[10]。ALP是成骨細胞礦化過程中主要的功能活性酶，富含于胞漿中，它可分解有機質(zhì)中的磷酸，增加局部無機磷酸濃度，促進礦化[11]。ALP是成骨細胞特有的標志性酶，它的活性越高提示細胞的成骨能力就越強，ALP在細胞中表達的量和活性，可以反映出細胞的分化程度和功能狀態(tài)[12]。本實驗中，間充質(zhì)細胞經(jīng)IGF-1培養(yǎng)5 d，可見ALP的活性增強，培養(yǎng)10 d可見ALP的活性顯著增強。提示細胞的分化特性已明顯不同于原來的細胞。從表2可以看出培養(yǎng)10 d的堿性磷酸酶活性增高。與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。在IGF-1作用下，間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化，因此認為，IGF-1可以誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞分化為成骨細胞。

隨著分子生物學的發(fā)展和應(yīng)用,從各方面對影響和調(diào)控骨縫間質(zhì)變化的認識越來越深入，發(fā)現(xiàn)多種細胞因子能誘導(dǎo)上頜骨縫中未分化的間充質(zhì)細胞不可逆地分化形成軟骨和骨,從而導(dǎo)致新骨的形成，促進上頜骨的發(fā)育。研究骨縫中間充質(zhì)細胞成骨能力的調(diào)控及影響因素對顱頜面生長發(fā)育、顱頜骨畸形的防治均有重要的意義。

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EffectofIGF-1onInducedDifferentiationofEctomesenchymalCellsofSDFetalRatMandibularProcesstoOsteoblastinVitro

SUN Li-cong,LI Song,ZHANG Yu-kun

(Luoyang Third People’s Hospital,Luoyang 471002,China)

ObjectiveTo develop a culturing model for the rat undifferentiated ectomesenchymal cells and to investigate the process of IGF-1 on inducing the ectomesenchymal cells to differentiate to osteoblasts．MethodsThe rat ectomesenchymal cells were separated by trysin.The ectomesenchymal cells of SD fetal rat mandibular were cultured in vitro，therefore the incubated models were established and cultured for 10 days in DMEM/F12 containing 20 ng/mL IGF-1．The morphology was observed by phase-contrast microscopy and HE staining．Immunohistochemistry was used to identify the characteristics of cells．Alkaline phosphatase was tested．ResultsThere were significant changes in the morphology of the cells after 10 days cultured in IGF-1．The cells change from fibroblast-like to multilateral and cuboid．Anti-collogen type I was positive．Alkaline phosphatase activity．ConclusionEctomesenchymal cells can be differentiated to osteoblasts by IGF-1．The cells change from fibroblast-like to multilateral and cuboid．The cells secrete Alkaline phosphatase and collogen type-Ι，There are the features of the osteoblast．

ectomesenchymal cell；osteoblast；IGF-1；cell differentiation；immunohistochemical

2013-01-25

1.洛陽市第三人民醫(yī)院口腔科，河南洛陽 471001 2.云南省昆明醫(yī)科大學口腔學院，云南昆明 650051 3.總參軍訓(xùn)部洛陽市干休所，河南洛陽 471002

孫吏聰(1976-)，男，河南鞏義人，主治醫(yī)師，從事口腔醫(yī)學臨床工作。

R783

A

1672-688X(2014)01-0003-04