吳修紅，胡妮娜，李寶龍，周海純，楊恩龍，張淑香，周忠光

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040)

芍藥為傳統(tǒng)中藥，從南北朝開始分為赤、白兩種，2010版藥典收錄赤芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍 P.veitchii Lynch.的干燥根，主要為野生品;白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，多為栽培品。二者均來(lái)源于毛茛科芍藥屬植物，在生物基源上有很多共同特征，但在臨床應(yīng)用上有明顯區(qū)別，赤芍具有清熱涼血、散瘀止痛之功效;白芍則擅長(zhǎng)于平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)。經(jīng)典方劑桂枝茯苓丸中應(yīng)用赤芍為臣藥，現(xiàn)代制劑桂枝膠囊中則使用了白芍。課題組前期采用臍中穴給藥方式明確了桂枝茯苓丸的鎮(zhèn)痛、抗炎效果［1－2］，本研究在前期研究基礎(chǔ)上［3－5］，采用臍中穴給藥方式，探討赤芍與白芍兩藥物與桂枝茯苓方劑藥理作用相關(guān)的鎮(zhèn)痛、抗炎及活血方面作用異同。

1 材料

1.1 儀器

AB265－S電子天平，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;YLS－6A智能熱板儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)。

1.2 藥品與試劑

赤芍、白芍、桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁等藥材均購(gòu)自于北京同仁堂(哈爾濱)藥店，赤芍、白芍經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)孫慧峰副教授鑒定分別為毛茛科植物芍藥P.veitchii和P.lactiflora的干燥根，其余各藥材也均為正品。

散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)131005);二磷酸腺苷二鈉(SIGMA公司，批號(hào)093K7010);AB－8型大孔吸附樹脂(南開大學(xué)化工廠)。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠，雌性，體重18～22 g;SPF級(jí)Wistar大鼠，雌性，體重180～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供，合格證號(hào)分別為SYXK黑2013－012、SCXK黑2013－004。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 赤芍、白芍及桂枝茯苓貼膜劑制備

赤芍、白芍貼膜劑:赤芍、白芍藥材各0.5 kg，70%乙醇提取后，分別用大孔吸附樹脂精制，收集20%乙醇洗脫部位，減壓回收至無(wú)醇味后，冷凍干燥，加入基質(zhì)，分別制成貼膏劑。

桂枝茯苓貼膜劑:取桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁分別粉碎(1∶1∶1∶1∶1)，桂枝、牡丹皮提取揮發(fā)油，藥渣再與其余各藥物醇提，減壓回收、冷凍干燥成干粉，加入之前提取的揮發(fā)油，再加入基質(zhì)，制成貼膏劑。

2.2 對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓炎癥的影響

取體重18～22 g的小鼠60只，雌性，根據(jù)體重按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(0.65 g/kg)、赤芍貼敷組(2.0 g/kg)、白芍貼敷組(2.0 g/kg)、桂枝茯苓貼敷組(4 g/kg)。將小鼠腹部用脫毛劑(非穴位組為背部)脫毛，以胸腹正中，胸骨柄上緣至外生殖器聯(lián)線上3/4與下1/4交界點(diǎn)為中心貼敷給藥，給藥面積6 cm2/10 g?？瞻讓?duì)照組貼敷同劑量的基質(zhì)，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊(0.65 g/kg)，桂枝茯苓貼膏劑貼敷給藥組分別臍中穴貼敷給予相當(dāng)于原藥材4 g/kg體重的桂枝茯苓貼膏劑，每日給藥1次，連續(xù)7天。第7天給藥1 h后，于左耳前后兩面均勻涂抹二甲苯，右耳作空白對(duì)照。30 min后將小鼠脫頸椎處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用8 mm打孔器于同一部位打下圓耳片，稱重，以兩耳片質(zhì)量差表示炎癥程度，以組間t檢驗(yàn)比較各給藥組與模型組間差異的顯著性。

2.3 對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

分組及給藥方式、給藥劑量、給藥周期同“二甲苯致小鼠耳廓炎癥反應(yīng)”的處理方法。于末次給藥1 h后，腹腔注射0.7%HAc溶液0.15 mL/10 g，觀察注射HAc后15 min內(nèi)小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)次數(shù)。

2.4 對(duì)大鼠血小板聚集的影響

健康Wistar大鼠，雌性，體重180～220 g，60只，按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為5組，每組12只，分組及給藥周期同“二甲苯致小鼠耳廓炎癥反應(yīng)”，給藥劑量分別為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊，0.45 g/kg)、赤芍貼敷組(1.4 g/kg)、白芍貼敷組(1.4 g/kg)、桂枝茯苓貼敷組(相當(dāng)于生藥2.7 g/kg)。第7天給藥結(jié)束后1 h，腹主動(dòng)脈取血5 ml，枸櫞酸鈉1∶9抗凝，以500 rpm離心5 min，制備富血小板血漿(PRP)，余血漿以4000 rpm離心10 min，制備貧血小板血漿(PPP)。用PPP調(diào)PRP中血小板數(shù)為4～6×108個(gè)/mL，取各組PRP 200 μL加入比濁杯中，溫孵10 min，PPP調(diào)100%透光率，加入誘聚劑ADP(終濃度為10 μL/L)、膠原(終濃度為50 μg/mL)誘導(dǎo)，按比濁法測(cè)定最大聚集率。實(shí)驗(yàn)在采血后4 h內(nèi)完成。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，均以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓炎癥的影響

與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照藥散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組和桂枝茯苓貼膏劑組均有顯著性差異(P＜0.05);赤芍貼膏劑組、白芍貼膏劑組無(wú)顯著性差異，但對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓炎癥有一定的作用趨勢(shì)，兩組之間無(wú)顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照藥散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組、赤芍貼膏劑組、白芍貼膏劑組和桂枝茯苓貼膏劑組均有顯著性差異(P＜0.05);赤芍貼膏劑組、白芍貼膏劑組和桂枝茯苓貼膏劑組組間無(wú)顯著性差異;但白芍貼膏劑組相對(duì)于赤芍貼膏劑組有作用增強(qiáng)趨勢(shì)，桂枝茯苓貼膏劑組無(wú)論相對(duì)于白芍還是赤芍貼膏劑組均表現(xiàn)出更強(qiáng)的作用趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 赤芍、白芍臍中穴給藥對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓炎癥的影響(n=10)

表2 赤芍、白芍臍中穴給藥對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響(n=10)

3.3 對(duì)大鼠血小板聚集的影響

對(duì)ADP和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照藥散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組、赤芍貼膏劑組和桂枝茯苓貼膏劑組均有顯著性差異(P＜0.05);白芍貼膏劑組無(wú)顯著性差異，但呈現(xiàn)一定的作用趨勢(shì)，且對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集作用趨勢(shì)更強(qiáng)。陽(yáng)性對(duì)照藥散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組、赤芍貼膏劑組和桂枝茯苓貼膏劑組雖各組之間作用程度有差別，無(wú)顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 赤芍、白芍臍中穴給藥對(duì)大鼠血小板聚集活性的影響(n=10)

4 討論

赤芍與白芍在臨床應(yīng)用較多，赤芍更擅長(zhǎng)活血、涼血，而白芍則側(cè)重于止痛、補(bǔ)血。王瑞等［6］研究顯示白芍和赤芍不同提取物對(duì)于炎性水腫與炎性滲出均有不同程度的治療效果，本研究中赤芍和白芍貼膏劑也顯示有一定程度的抗炎作用趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著性;由赤芍組成的桂枝茯苓貼膏劑抗炎作用則呈顯著性差異。赤芍貼膏劑、白芍貼膏劑、桂枝茯苓貼膏劑3組均有不同程度的止痛作用，3組作用強(qiáng)度上桂枝茯苓貼膏劑組最強(qiáng)、白芍貼膏劑組次之，但強(qiáng)度差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。赤芍貼膏劑對(duì)ADP和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集有抑制作用，與赤芍的活血作用［7］相一致，差異具顯著性;桂枝茯苓貼膏劑組也呈現(xiàn)相同作用，且作用強(qiáng)度有增強(qiáng)趨勢(shì);白芍貼膏劑組則無(wú)此作用。研究中赤芍及白芍的抗炎作用無(wú)顯著性差異是否由于給藥途徑改變引起作用差異，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

桂枝茯苓方劑由桂枝、茯苓、丹皮、桃仁、芍藥組成，具有溫經(jīng)通絡(luò)、緩消癥塊之功，對(duì)血瘀引起的痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥等具有較好的治療效果。研究結(jié)果證明桂枝茯苓貼膏劑具有抗炎、鎮(zhèn)痛和活血化瘀作用，作用強(qiáng)度相對(duì)于赤芍單味藥物臍中穴給藥具有增強(qiáng)趨勢(shì);同時(shí)赤芍與白芍相比，赤芍與桂枝茯苓貼膏劑作用更一致，一方面驗(yàn)證了中醫(yī)方劑用藥的科學(xué)性，另一方面也驗(yàn)證了桂枝茯苓方劑由赤芍組成的合理性。

［1］吳修紅，李寶龍，楊恩龍，等.桂枝茯苓貼膏劑臍中穴給藥的鎮(zhèn)痛、抗炎作用研究［J］.針灸臨床雜志，2014，30(2):65 －68

［2］吳修紅，劉麗佳，王喜軍.桂枝茯苓丸及組成中藥化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，38(6):102 －105

［3］孫麗梅，周忠光，郭建敏，等.不同促透劑對(duì)脂溶性基質(zhì)制劑臍中穴經(jīng)皮給藥作用研究［J］.中醫(yī)藥信息，2010，27(1):20－22

［4］田明，周忠光，胡鵬，等.透皮促進(jìn)劑對(duì)水溶性基質(zhì)制劑臍中穴經(jīng)皮給藥作用研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，38(2):94 －96

［5］田明，周忠光，范越，等.臍療法的藥劑學(xué)研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥信息，2008，25(4):9 －12

［6］王瑞，魯嵐，李穎偉，等.赤芍與白芍的藥理作用比較［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)，2010，16(7):112 －114

［7］Jin Songnan，Wen Jinfu，Wang Tingting，et al.Vasodilatory effects of ethanol extract of Radix Paeoniae Rubra and its mechanism of action in the rat aorta［J］.J Ethnopharmacol，2012，142(1):188 － 193