GU Baoxiang，WANG Xiying，QIAO Mingxiao，XU Chunxiang，ZHANG Jiwei，CAO Zhilin

(1.Resources and Environment Institute，Henan Institute of Engineering，Zhengzhou 451191，China; 2.Library of Henan Institute of Engineering，Zhengzhou 451191，China; 3.Zhengzhou Technical College，Zhengzhou 450121，China;4.State Key Laboratory of Bioelectronics，Southeast University，Nanjing 210018，China)

The Study of Phenol Pollution Water Detection Based on Nanostructure ZnO*

GU Baoxiang1*，WANG Xiying2，QIAO Mingxiao3，XU Chunxiang4*，ZHANG Jiwei1，CAO Zhilin1

(1.Resources and Environment Institute，Henan Institute of Engineering，Zhengzhou 451191，China; 2.Library of Henan Institute of Engineering，Zhengzhou 451191，China; 3.Zhengzhou Technical College，Zhengzhou 450121，China;4.State Key Laboratory of Bioelectronics，Southeast University，Nanjing 210018，China)

In present work，ZnO nanorods with uniform size were fabricated through vapor transport method.Based on the biocompatibility of ZnO nano-material，a electrochemistry biosensor for phenol pollution detection is constructed through modification of the tyrosinase on ZnO nanorods surface.The fabricated condition for ZnO nanorods and the influence factor of biosensor in detection is discussed.The response of biosensor for phenol and catechol detection is quickly and sensitive.The linearity range of detection for phenol and catechol is respectively 0.02 mmol/L～0.12 mmol/L and 0.01 mmol/L～0.4 mmol/L，sensitivity is respectively 0.83 μA/(mmol/L)and 2.14 μA/ (mmol/L)，detection limit is respectively 15.57 μmol/L and 4 μmol/L.That performed a wider prospect for the development and application of ZnO nanostructure biosensor.

biosensor;detection for phenolic compounds pollution;electrochemistry;ZnO nanostructure

ZnO是一種ⅡB－ⅥA族直接寬帶隙(帶隙3.37 eV)半導(dǎo)體材料，由于奇特的光電性能和表面性能，近年來得到了廣泛的研究［1］，廣泛用于光電器件［2－3］、生物化學傳感器［4－5］、太陽能電池方面［6］。同時，ZnO納米材料特具有非常大的比表面積、良好的電子傳導(dǎo)能力、無毒、良好的生物兼容性、環(huán)境友好等特性，這更使其在生物傳感器上的應(yīng)用具有了得天獨厚的優(yōu)勢［7］。

目前合成ZnO納米材料的方法很多，包括氣相傳輸法［8］、金屬有機氣相外延生長［9］、水熱合成法［10］和磁控濺射法［11］等等。其中氣相傳輸法和水熱法是兩種廣泛使用的方法，氣相傳輸法在不同條件下可合成多種形貌的納米結(jié)構(gòu)氧化鋅。

酚類屬于高毒物質(zhì)［12］，隨著工業(yè)的發(fā)展和環(huán)境問題的日益突出，酚類物質(zhì)的污染也逐漸成為水源污染的主要危害和特征指標。目前，測定揮發(fā)酚的標準方法為4－氨基安替比林分光光度法。但方法繁雜，需要蒸餾，分析速度慢，且產(chǎn)生二次污染［13］。因此，人們開始重點關(guān)注利用電化學方法測定酚類化合物，使用電流型酪氨酸酶(Tyr)電極來測水中酚類污染物質(zhì)［14］，主要是基于Tyr可催化氧化苯酚為鄰苯二醌，鄰苯二醌在電極表面還原，產(chǎn)生還原電流可被用于檢測的原理［15］。此法檢測苯酚具有靈敏、準確、快速的特點。對于其他酚類物質(zhì)如鄰苯二酚、對氯苯酚、鄰甲酚等都有良好的響應(yīng)。

本文將氧化鋅納米棒(ZnO-NR)和Tyr在電化學傳感器領(lǐng)域中的特點結(jié)合起來，利用ZnO-NR的等電點與Tyr等電點的差異，將Tyr通過簡單的靜電吸附的原理組裝在ZnO-NR表面，利用Tyr對苯酚催化的特性構(gòu)建電流型的生物化學傳感器對苯酚進行檢測，實現(xiàn)了苯酚檢測的簡單、快速、準確的目標。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

鋅粉(上海申井化工有限公司，分析純)，Tyr (Tyrosinase，EC.1.14.18.1，活性≥1 000 unit/mg，凍干粉(Catalog No.T.3824)，Nafion溶液(10%(w/v))購自Sigmaaldrich公司，使用前未經(jīng)進一步純化。苯酚，pH 5.0～pH 9.0磷酸鹽緩沖溶液由0.1 mol/L Na2HPO4和NaH2PO4儲備液混合而成。實驗用水均為二次石英亞沸蒸餾水。

電化學測量采用上海辰華儀器公司出品的電化學工作站:CHI660C。實驗過程中采用自制的5 mL電解池，應(yīng)用傳統(tǒng)的三電極系統(tǒng)，以表面組裝了Tyr的ZnO-NR修飾電極、飽和甘汞電極(SCE)和鉑絲電極分別作為工作電極、參比電極和輔助電極。納米Tyr/ZnO修飾電極對底物的電催化響應(yīng)采用計時安培法進行測量，實驗控制電位在－0.2 V(vs.SCE)，于5 mL 0.1 mol/L pH 7.0的PBS緩沖溶液中，在磁力攪拌下，連續(xù)加入20 μL 0.01 mmol/L的苯酚溶液，記錄響應(yīng)電流－時間曲線。

納米ZnO修飾膜及ZnO/Tyr修飾膜的掃描電鏡圖是在JSM－5610LV型掃描電子顯微鏡(JEOL，日本)上得到的，加速電壓為15 kV。

1.2 ZnO-NR的制備

采用氣相傳輸法在硅片上制備ZnO-NR［16］。取長30 cm直徑4 cm一端封閉的石英管，將盛有0.1 g Zn粉的小石英舟置于石英管封閉端，在石英管開口端放置一片1 cm×10 cm的硅片。將石英管伸進管式爐中，使封閉端處在管式爐的高溫區(qū)，開口端在低溫區(qū)，按150/10的氮氧比通入載氣，抽真空，使管式爐高溫區(qū)加熱到750℃，保持30 min。停止加熱，打開真空閥，使爐內(nèi)壓力恢復(fù)至常壓，冷卻至室溫，取出石英管中的硅片，硅片上即附著一層白色的ZnO-NR。反應(yīng)示意圖如圖1所示。

圖1 氣相傳輸法制備ZnO-NR的示意圖

1.3 Tyr/ZnO修飾電極的制備

將玻碳電極分別在撒有1.0 μm和0.3 μm Al2O3漿的麂皮上拋光成鏡面，并依次用水和丙酮超聲清洗，用氮氣吹干待用。

將用氣相傳輸法合成的ZnO-NR從硅片上刮下后，用二次蒸餾水超聲清洗，然后加入一定量的二次蒸餾水至濃度約為2 mg/mL，該懸浮液作為ZnO-NR儲備液，放置干燥器中待用。準確稱取一定量Tyr溶于蒸餾水制成2 mg/mL儲備液置于4℃冰箱中備用。

將上述ZnO-NR懸浮液與Tyr溶液等體積混合，充分攪拌后放入冰箱中靜置10 h。制備納米Tyr/ZnO電極(ZnO/Tyr/GCE)時，將上述Tyr與ZnO-NR混合液充分懸浮后取10 μL懸濁液滴至已拋光好的玻碳電極表面。控制實驗取10 μL ZnONR懸浮液或Tyr溶液滴在已拋光好的玻碳電極表面，分別制成ZnO-NR修飾電極(ZnO/GCE)和Tyr修飾電極(Tyr/GCE)。將制得的ZnO/Tyr/GCE、ZnO/GCE和Tyr/GCE電極置于干躁器內(nèi)，在4℃冰箱中干燥10 h。當修飾層完全干燥后，再在電極表面上滴加10 μL 2.5%的Nafion溶液，靜置并待完全干燥后用水清洗并進行電化學測量。

2 結(jié)果與討論

2.1 Tyr/ZnO-NR修飾電極的制備與表征

ZnO-NR等電點為9.5，在中性pH溶液中帶正電，而Tyr的等電點為4.7～5.0［17］，中性溶液中帶負電。因此，由于靜電吸引作用，Tyr會自發(fā)的吸附在納米ZnO表面，吸附Tyr前后的ZnO-NRSEM照片如圖2所示。

圖2 組裝Tyr前后的ZnO-NR形貌照片

從圖2中可以看出來，未修飾過的ZnO-NR表面光滑平整，而吸附有Tyr的ZnO-NR表面出現(xiàn)了一些胞點，說明Tyr成功組裝到了ZnO-NR上，間接證明了低等電點的Tyr能夠被高等電點的ZnO-NR吸附。

2.2 Tyr/ZnONR的電催化性質(zhì)

2.2.1 循環(huán)伏安方法

當Tyr吸附在ZnO-NR上構(gòu)成Tyr/ZnO修飾電極時，因ZnO-NR良好的生物兼容性，所以吸附態(tài)的Tyr能很好地保持其生物活性，因此對酚類化合物的氧化具有很高的電催化活性。圖3是Tyr/ZnO修飾電極在含有溶解氧氣的磷酸鹽緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖。

圖3Tyr/ZnO-NR修飾電極在PBS緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖

圖3 中可以看出，向緩沖溶液中加入苯酚時，從0.2V起還原電流急劇增加。這是由于苯酚在電極上吸附的Tyr催化作用下與緩沖溶液中的溶解氧反應(yīng)生成鄰苯二酚并進一步氧化生成鄰苯二醌，導(dǎo)致還原峰電流增加［18］。由于二苯醌不穩(wěn)定，在溶液中很容易發(fā)生聚合或其他反應(yīng)被除去。電極上的反應(yīng)過程示意如圖4所示。

圖4 電極表面反應(yīng)示意圖

在圖4中，苯酚在溶液中和電極上的Tyr作用，被催化為苯二酚，苯二酚繼續(xù)與Tyr反應(yīng)，被催化為苯二醌，過程中電子由Tyr傳遞給ZnO-NR，由于ZnO-NR優(yōu)良的導(dǎo)電性能，把電子傳遞給電極，產(chǎn)生了電流效應(yīng)。反應(yīng)的過程如下所示:

2.2.2 安培方法(時間電流響應(yīng)曲線方法)

還原電流和苯酚濃度之間的關(guān)系由安培實驗進行驗證，安培實驗是在不斷攪拌情況下，應(yīng)用電位為－0.2 V，在5 mL pH7.0的PBS溶液中，連續(xù)加入10 μL苯酚，記錄電流時間曲線見圖5(a)curve1。用鄰苯二酚代替苯酚，亦可觀察到該電極對鄰苯二酚的安培響應(yīng)，并具有比苯酚更快速的響應(yīng)和更大的響應(yīng)電流(圖5(a)curve2)。該傳感器對兩種酚的電化學響應(yīng)，分別在300 s和200 s達到95%的穩(wěn)態(tài)電流。

圖5

從圖5(b)可看出，在0.02 mmol/L～0.18 mmol/L和0.01 mmol/L～1 mmol/L濃度范圍內(nèi)，該傳感器對鄰苯二酚和苯酚具有快速的安培響應(yīng)。如圖5(b)。線性范圍分別為0.02 mmol/L～0.12 mmol/L和0.01 mmol/L～0.4 mmol/L，靈敏度分別為0.83 μA/(mmol/L)和2.14 μA/(mmol/L)，檢測限分別為15.57 μmol/L和4 μmol/L(檢測限是指三倍噪音的濃度)。其中對苯酚檢測的線性范圍大于Adriana Faria Azevedo等在2011年用方波伏安法對苯酚的檢測線性范圍［19］40 μmol/L～250 μmol/L，而靈敏度相當，說明這種方法對苯酚的檢測時響應(yīng)靈敏，適應(yīng)范圍寬，耐濃度變化的沖擊。

當濃度分別大于0.12 mmol/L和4 mmol/L時，曲線趨于水平，說明由于催化作用而產(chǎn)生的電流信號趨于飽和，這與酶促反應(yīng)的米氏性質(zhì)一致。與酶的親和性有關(guān)的的米氏常數(shù)(KMapp)，可根據(jù)Lineweaver-Burk［20］方程求出，對苯酚和鄰苯二酚其KM分別為0.24 mmol/L和1.75 mmol/L。該數(shù)值

app與由自組裝技術(shù)構(gòu)建的電流型Tyr傳感器(= 0.13 mmol/L)［21］以及聚乙烯膜修飾Tyr傳感器(=0.11 mmol/L)［22］數(shù)值相近，說明Tyr在該修飾電極上對底物有極大的親和性。

2.2.3 實際水樣測試

為了驗證本傳感器對苯酚濃度的檢測效果，研究組人員分別取了鄭州市某化工有限公司酚醛樹脂車間廢水水樣和出廠排放水樣(廢水中含有苯酚)，進行苯酚濃度傳感檢測，檢測結(jié)果如圖6所示。

圖6實際水樣檢測結(jié)果

圖6 中，黑色方形結(jié)點拆線為用本傳感器測試苯酚標準溶液所得的標準曲線，綠色水平線為檢測車間廢水水樣所得電流響應(yīng)信號強度，垂直綠色虛線箭頭指向橫軸的一點即是車間廢水水樣的苯酚濃度，由圖可知約為0.24 mmol/L，或22.5 mg/L。同樣，紅色水平線為出廠廢水水樣檢測時所得電流響應(yīng)信號強度，其對應(yīng)的苯酚濃度約為0.015 mmol/L或1.4 mg/L。

2.2.4 干擾實驗

干擾實驗分別用苯和乙醇進行，實驗中發(fā)現(xiàn)無論用苯和乙醇，都不能使傳感器產(chǎn)生明顯響應(yīng)，其電流響應(yīng)曲線近似水平直線。由酪氨酸酶催化的底物要求可知，此傳感器對酚類物質(zhì)的傳感響應(yīng)是有著特異性的。

2.2.5 修飾電極的穩(wěn)定性和重復(fù)性

該傳感器不用時可保存在4℃PBS溶液中或干燥器中。一星期后可保留87.3%的原始催化活性。連續(xù)使用兩天(各8 h)，可保持81.2%的催化活性，由此可見該傳感器有很好的穩(wěn)定性。采用同種方法分別制備三支電極，在0.1 mmol/L的苯酚溶液中穩(wěn)態(tài)電流響應(yīng)誤差為91.8%，表現(xiàn)出很好的制備重復(fù)性。

3 結(jié)論

ZnO-NR能吸附負電性的Tyr，在Nafion形成的穩(wěn)定均一分布的多孔性網(wǎng)狀膜固定在電極表面時，表現(xiàn)出比純ZnO-NR層更優(yōu)異的電子傳遞性質(zhì)。吸附在ZnO-NR上的Tyr能有效保持其生物活性，對酚類化合物具有優(yōu)異的催化性能并反應(yīng)為電化學響應(yīng)，實驗條件下對苯酚和鄰苯二酚檢測的線性范圍分別為0.02 mmol/L～0.12 mmol/L和0.01 mmol/L～0.4 mmol/L，靈敏度分別為0.83 μA/(mmol/L)和2.14 μA/(mmol/L)，檢測限分別為15.57 μmol/L和4 μmol/L(檢測限是指三倍噪音的濃度)。為酚類化合物的測定和納米生物傳感器的構(gòu)建提供了新的途徑。

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谷保祥(1971－)，男，河南尉氏人，博士，講師，主要研究方向為納米材料生物化學與免疫傳感器原理與應(yīng)用研究，gbxokey@126.com;

徐春祥(1965－)，男，江蘇楊州人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事光電功能材料與器件研究，xcxseu@seu.edu.cn。

基于納米結(jié)構(gòu)氧化鋅的水體酚類污染監(jiān)測研究*

谷保祥1*，王喜英2，喬明曉3，徐春祥4*，張繼偉1，曹志林1
(1.河南工程學院資源與環(huán)境學院，鄭州451191;2.河南工程學院圖書館，鄭州451191; 3.鄭州職業(yè)技術(shù)學院，鄭州450121;4.東南大學生物電子國家重點實驗室，南京210018)

利用氣相傳輸法制備了形貌均一、尺寸適當?shù)募{米ZnO棒，并利用其良好的生物兼容性在其表面組裝了酪氨酸酶進行酚類物質(zhì)水體污染的電化學檢測傳感研究。討論了ZnO納米結(jié)構(gòu)制備的條件優(yōu)化和用于傳感的響應(yīng)結(jié)果與影響因素。該傳感器對鄰苯二酚和苯酚具有快速的安培響應(yīng)。線性范圍分別為0.02 mmol/L～0.12 mmol/L和0.01 mmol/L～0.4 mmol/L，靈敏度分別為0.83 μA/(mmol/L)和2.14 μA/(mmol/L)，檢測限分別為15.57 μmol/L和4 μmol/L，為納米結(jié)構(gòu)ZnO在生物化學傳感方面的應(yīng)用展示了廣闊的應(yīng)用前景。

生物傳感器;苯酚污染監(jiān)測;電化學;納米ZnO

X502

A

1004－1699(2014)04－0421－05

2013－10－15修改日期:2014－03－21

C:7230J;7230L

10.3969/j.issn.1004－1699.2014.04.001

項目來源:河南省教育廳科技攻關(guān)重點項目(112102310554);河南工程學院博士基金項目(D2012001);河南工程學院創(chuàng)新團隊建設(shè)計劃項目(CXTD2014005);河南省高校煤礦環(huán)境地質(zhì)災(zāi)害防治工程技術(shù)研究中心項目(1205)